هلام البولي أكريليك الكهربائي وجود N TKE و msmcz من ديناتوربيغ ~ المذيبات ، ~ RCHARD M ROBSON و LB TABATABA و WR DAYTON و MG ZEECE و DE GOU و MH STROMER كلاهما لهما هلام ممتد الحالة الكهرومغناطيسية. بحث وتشخيص tdol منذ تقديمه قبل عدة سنوات (Raymond and Weintraub، 1959؛ Davies، 1964؛ Orenstein، 1964) ، تم تحسين هذه التقنية وتحسينها باستمرار وهي تعد بأن تكون مفيدة في المستقبل.
بعض الخلفيات والمفاهيم الكامنة وراء PAGE هناك العديد من الاختلافات في طريقة البحث ، ولكن هذه المقالة تقتصر على مناقشة الرحلان الكهربائي للقرص التقليدي ، والذي يشار إليه غالبًا باسم طريقة Ornstein-Davis (Ornstein ، 1964 ؛ Davis ، 1). 4) ، وإلى الاستخدام الذي تم تطويره مؤخرًا لـ PAGE الذي يتم إجراؤه في وجود المنظفات الأنيونية ، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS3) ، على الرغم من أن موضوع هذا البحث يستخدم مواد هلامية بولي أكريلاميد في منطقة الرحلان الكهربي ، وهلام بولي أكريلاميد أيضًا للتركيز الكهروضوئي للبروتينات والنووية الأحماض مفيدة (Florini et al ، 1973 ؛ Righetti and Drysdale ، 1973 ؛ Wellner and Hayes ،
و isotaechophoresis (Svendsen ، 1973) بعد مراجعة موجزة لـ PAGE ، سيتم توضيح فائدة هذه الطريقة من خلال مناقشة العديد من مشكلات البحث من مختبرنا ، على الرغم من أن PAGE غالبًا ما تستخدم في دراسات الأحماض النووية والجزيئات الكبيرة المشحونة. جميع الأمثلة المختارة تتعلق باستخدامه في عزل البروتينات ، ومن المأمول أن توضح هذه الأمثلة استخدام هذه التقنية خصيصًا لبيولوجيا العضلات وأبحاث علوم اللحوم.
يتم عرض المنتج النهائي للبلمرة والربط المتبادل للمونومر ، والأكريلاميد ، ومكونومر الترابط المتقاطع ، N ، N1- ميثيلين- بيساكريلاميد (يشار إليه غالبًا باسم “Bis”). محطة التجربة الاقتصادية ، أميس ، مشاريع فرجينيا 1796 و 2025 تم دعم الدراسات الأولية الواردة في هذه المراجعة جزئيًا من خلال المنح المقدمة من National nstitutes of Health (HL and AM 12654) ، ورابطة الضمور العضلي الأمريكية ، وجمعية القلب owa المقدمة في اختصارات المؤتمر السابع والعشرين لجمعية علوم اللحوم الأمريكية المستخدمة في هذه المقالة: PAGE ، polyacrylamide gel electrophoresis. SDS ، كبريتات دوديسيل الصوديوم ؛ عامل تنشيط CAF، Ca2 +
200 N، N’-methylene-bis-acrylanide (Bis) acrylamide (monomer) CH2 = CH c = o NH2 + nitators 3 CH2 = CH C = O NH + FH2 NH F = O الشكل 1 تفاعل بلمرة أكريلاميد متصالب – المركب الديناميكي لل Cariamide
3201 مشترك مشترك NH – co -C H2 -CH [C H2-C H 3 XC H2-C H – [C H2-fH -1 xc H21 CO co NH NH2 co NH2 CH2 NH co -C H2-C H – [C H2-C H-3 1 co XC H2-C H – [C H2-C H – xc H2 co CQ الشكل 2. هيكل جل بولي أكريلاميد يظهر سلاسل طويلة من مونومرات الأكريلاميد المبلمرة التي شكلها المونومر هو B.
4-202-0- = التشابك = البوليمرات العشوائية -m- = = الملفات المتنامية لنقاط الربط المتشابك 111 = الهيكل النهائي للجيل الشكل 3 تمثيل تخطيطي لتفاعل البلمرة المؤدي إلى الهيكل ثلاثي الأبعاد لجيل بولي أكريلاميد مقتبس من مورر (1971 ) حجم عينة المخزن المؤقت العلوي أو فاصل (التراص) هلام فصل البروتين المخزن السفلي الشكل 4 تمثيل تخطيطي للإعداد التجريبي الأساسي للهلام الكهربي بولي أكريلاميد
5 في الشكلين 1 و 2 ، يتطلب تفاعل البلمرة إضافة أيون بادئ (الجدول 1). مزيج من بيرسلفات الأمونيوم و TW&D هو النظام الأكثر استخدامًا للبلمرة الكيميائية. يشير التعرض للأكسجين الجزيئي إلى البلمرة في هذا النظام.
الجدول 1 أمثلة على أنظمة NTATORs من polymerzaton (أنظمة محفز أوكسيدوكس) 1 بيرسلفات الأمونيوم [(NH4) 2S208] و TENED 2 ريبوفلافين و TEMED [N ، N ، N 1 ، N 1 ، N ثنائي إيثيلين حراري] المواد الهلامية بولي أكريلاميد العملية الشاملة المؤدية إلى الشكل 3: نمو سلاسل بولي أكريلاميد بواسطة بلمرة الزينيل ينتج ملفات هلام بوليمر عشوائية (الخطوة 1) تزايد الملفات وهي مركزة للغاية
(الخطوة 11 متصالبة) لتشكيل الهيكل النهائي الشبيه بالشبكة (الخطوة 111) ترتبط الخصائص الفيزيائية للهلام (اللزوجة والمرونة والكثافة والقوة الميكانيكية) بتركيز المونومر والمكونومر في المحلول الأصلي ، يتم تحديد درجة البلمرة (طول السلسلة) ، ودرجة الارتباط المتبادل الذي يحدث. يتم توفير متوسط نصف قطر المسام غير الفعال من حوالي 0.5 إلى 3 أو 4 نانومتر ببساطة عن طريق ضبط إجمالي تركيز مادة الأكريلاميد (تقليل إنتاج الأكريلاميد مع المسام الكبيرة) وعامل الربط المتقاطع (Chrambach and Rodbard ، 1971). <1000) بالإضافة إلى الوزن الجزيئي المرتفع للغاية RNA (vlw> 10) نسبة وزن الأكريلاميد إلى B صغيرة جدًا نسبيًا (<هنا تقريبًا) ، المواد الهلامية تميل إلى أن تكون هشة للغاية وغير شفافة ،
من ناحية أخرى ، إذا تجاوزت نسبة الوزن حوالي 100 ، فإن المواد الهلامية تكون عجينة وتتكسر بسهولة ، ويتراوح تركيز مونومر الأكريلاميد من حوالي 25 إلى 3 وتتوافر نسبة المونومر إلى B isis. مع نسبة وزن تقارب 30 أو 40 إلى 1 في الممارسة العامة ، يتم تصنيع محاليل مخزون الأكريلاميد و B بنسب معروفة ويتم تبريدها للاستخدام المريح. يتم وضعه في أنبوب زجاجي (قالب Orslab) بين الخزانات العازلة العلوية والسفلية. عادة ما يتم خلط العينة مسبقًا في 10 إلى 5074 سكروز أو محلول جلسرين (لزيادة الكثافة) وتوضع على الجزء العلوي من الجل. يتم تطبيق مجال كهربائي عبر الهلام و
204 يتم عادةً مراقبة تقدم الجري باستخدام صبغة تتبع مرئية مثل أزرق بروموفينول.
-طريقة ديفيس) ، عادة ما يتم وضع هلام فصل (مكدس) مع مسام كبيرة أعلى هلام فصل مع مسام أصغر (الشكل 4). اشتق اسم “الرحلان الكهربائي للقرص” في الأصل إلى حد ما من اعتماد هذه التقنية على الانقطاعات. تم تلخيص المصفوفة الكهربي (Ornstein ، 1964) للرحلان الكهربي للقرص النموذجي في الجدول 11. باستخدام هذه الطريقة ، يكون نظام الفصل متقطعًا وفقًا لقيمة الأس الهيدروجيني وتكوين المخزن المؤقت وحجم المسام في هلام بولي أكريلاميد. هذه المتغيرات بدورها تخلق جهدًا متقطعًا و ph. قبل فصل التدرجات في هلام الغربلة أو الفصل (الشكل 4) ، تخلق هذه الانقطاعات مناطق بدء ضيقة جدًا ومركزة (نطاقات) في هلام التراص.
يساهم في قوة حل عالية للرحلان الكهربائي للقرص (انظر Ornstein ، 1964 ، و Davis ، 1964 ، للحصول على وصف أكثر اكتمالاً لتراكم phemmmenon) يعتمد على وحدة الكتلة. حجمها وشكلها أثناء التحرك عبر مسام الهلام (المنخل الجزيئي) يوضح الجدول 11 العلاقة التقريبية بين تركيز مادة الأكريلاميد وحجم البروكريتينات التي يمكن فصلها في مثل هذا الهلام. تعتبر الجزيئات الكبيرة غير المتماثلة للغاية) ونسبة المونومر إلى Bis من العوامل المحددة المهمة أيضًا. وظيفة منظم Gel-Kehlrauch (2) تأثير الشحنة الكهربائية – تنقسم الجزيئات على أساس الشحنة الكهربائية الصافية 3) تأثير المنخل الجزيئي – بناءً على حجم الجزيء (الوزن الجزيئي) والشكل
الجدول 111 العلاقة التقريبية بين تركيز مادة الأكريلاميد وحجم بروتينات BNG المعزولة بواسطة DSC E ؛ الأكريلاميد $ الأكريلاميد (مونومر)
النطاق التقريبي ميغاواط من 3 إلى 7 a1،000،20،00-1،000،30،00،000-1،000،30،00،00،000-1،000،00،000-1،000،000 يمكن التعبير عن قابلية حركة مواد الترشيح الهلامية في شكل المعادلة M = qEf ، حيث M هي الحركة الكهربي بالسنتيمتر / الثانية ، الشحنة على مجال جزيء البروتين.
cm وثابت الاحتكاك (Peterson، 1971) يرتبط ثابت الاحتكاك f بالثابت D في الوسط الذي يمر به. في ظل ظروف الرحلان الكهربي المحددة ، يمكن إجراء مقارنة مباشرة للهجرة بشرط إجراء تجارب مختلفة في نفس الظروف. المسافات لمزيد من المناقشة الكاملة لمبادئ الرحلان الكهربائي ، انظر Maurer (1971) ، Gordon (1969) ، Orenstein (4 $) ، and Davis (1964).
تتيح المحاليل العازلة ذات القوة الأيونية المنخفضة معدلات هجرة عالية مع تطور حرارة منخفضة ، في حين أن مخازن القوة الأيونية العالية ، ومعدلات الهجرة المنخفضة وزيادة القوة الأيونية لتوليد الحرارة ، تمثل مشكلة صعبة للغاية في الرحلان الكهربائي للقرص التقليدي لبعض بروتينات ما قبل الهيكل العظمي. يبني العضلات. من الضروري أن يكون لديك جهد كهربي كافٍ للفصل الكهربي الجيد.
تم تحقيق نجاح محدود للغاية مع الرحلان الكهربائي للميوسين ، وفقط عندما يتم إجراؤه في وجود WeA (ظروف تلغي الأهداف الأساسية للعديد من دراسات الرحلان الكهربي) و Wi. باستخدام مواد هلامية بولي أكريلاميد مخففة جدًا (Florini and Brivio ، 1969) ، لوحظت أيضًا بعض المشكلات مع التروبوميوسين ، وهو لزج جدًا عند نقاط القوة الأيونية المنخفضة.
وبالتالي يميل إلى التراكم مع العديد من المخازن المؤقتة المفضلة. يتم الاحتفاظ بالقوة الأيونية بالقرب من الصفر ، ويخضع G-actin لبعض البلمرة (ربما يكون التجميع هو أفضل كلمة لأنه لا توجد روابط تساهمية بين مونومرات G-actin) إلى F-actin O عالي اللزوجة للبروتينات الليفية العضلية ، يحتوي a-actinin الخصائص (قابلية الذوبان المنخفضة والقوة الأيونية المعتدلة) التي يمكن دراستها جيدًا عن طريق الرحلان الكهربائي (Robson and Zeece، 1973؛ Suzuki et al.، 1973).
206 TABLE V SDS-POLYACRYLAMDE GEL هيكل الكهربة SDS = CH (CH2) loCH20S03Na + وصف أيون (1) بروتين مشوه (سلسلة منفصلة)
ما يقرب من 14 جرامًا من أنيون SDS المرتبط لكل جرام من البروتين يجعل جميع الجزيئات مشحونة سالبًا (2) يتم تمديد كل سلسلة بولي ببتيد في هيكل يشبه القضيب. 1960s (Shapiro et al. ، 1967) لا يمكن المبالغة في تقديرها ، حيث أن أحد مقاييس فائدتها هو الاعتماد السابق للعديد من العلماء على تحليل التنبيذ الفائق كأحد التقنيات الأساسية لتحديد نقاء البروتين في هذه التقنية التي قللت
متوسط يحتوي على SDS (حوالي 01 إلى 16) أو 2-مركابتوإيثانول أو أورديثيوثريتول لتقليل ومنع روابط ثاني كبريتيد ، غالبًا ما يُفضل الغليان لمدة 5 إلى 10 دقائق للتخلص بسرعة أكبر من الخصائص المحللة للبروتينات الملوثة للبروتياز.
و Osborne (l) ، وهو نظام مستمر فيما يتعلق بالمخزن المؤقت. مع زيادة تركيز مادة الأكريلاميد (Dunker and Ruckert ، 1969 ؛ Swank and Munkries ، 1971) ، باستخدام تقنية discelectrophoreti c (Laenrmli ، 1970 ؛ Neville ، 1971) ، وإضافة اليوريا إلى النظام (Swank and Munkries ، 1971) ، تحسين الفصل أو تمديد النطاق الخطي للأوزان الجزيئية (حتى الوحدات المهاجرة في SDS-PAGE هي سلاسل أحادية (على سبيل المثال ، aa ctinin بوزن جزيئي 200،000 daltons يهاجر كوحدتين فرعيتين منفصلتين من 100،000 daltons) رينولدز وتانفورد (1970 ) أظهرت أن البروتينات المختلفة كميات متطابقة تقريبًا من SDS بتركيزات توازن لمونومر SDS أعلى من 05 ملي مول مع عدد كبير من جزيئات كبريتات دوديسيل سالبة الشحنة المرتبطة بسلسلة البروتين (قابل للتعديل V) ، حتى فرق الشحنة الكبير المتأصل في البروتينات (أي. ، الشحنة الصافية الناتجة عن المجموعات المؤينة لسلسلة البولي ببتيد منفصلة عن
يتم التخلص تقريبًا من الشحنة الصافية لمركب البروتين sds) (Dunker and Ruckert ، 1969).
تم توضيح الجدول S لمركب البروتين sds في SDS-PAGE جيدًا بواسطة Stoklosa و atz (1974) ، اللذين أبلغا مؤخرًا عن طريقة مبسطة. بالنسبة لـ SDS-PAGE حيث يتم استخدام SDS فقط في محلول العينة قبل التحميل ، وليس في حجرات الهلام أو القطب. تحتوي سلسلة البولي ببتيد المرتبطة بـ SDS على درجة عالية من المعلمات الهيدروديناميكية ، مما يشير إلى أن المركب عبارة عن جسيم يشبه القوس يختلف طوله بشكل فريد عن الجزيء.
وزن جزء البروتين. هذه النتائج ، إلى جانب النتائج التي تشدد على كمية ثابتة من SDS المربوط لكل وحدة كتلة ، تفسر الملاحظة التجريبية التي أجراها شابيرو وزملاؤه PAGE مرتبطة بوزنهم الجزيئي. نما استخدام هذه التقنية في معظم العلوم البيولوجية بعد التقارير اللاحقة لـ Weber and Osborne (1969) و Danker and Ruckert (1969). مجموعة متنوعة من البروتينات ، مع ملاحظة Shapiro et al (1967) أنه إذا تم رسم إمكانات SDS الكهربي مقابل لوغاريتم الأوزان الجزيئية لسلسلة البولي ببتيد المعروفة ، فإن منحنى سلس (خطي بشكل أساسي على نطاق MW محدد يعتمد على ينتج عن تركيز مونومر الأكريلاميد) L.
– في الممارسة العامة ، يتم تحضير المنحنيات القياسية باستخدام بروتينات (يمكن دمج ثلاثة أو أربعة منها وفصلها على هلام واحد) لها وحدات فرعية ذات أوزان جزيئية محددة جيدًا تم تحديدها مسبقًا بواسطة طرق فيزيائية كيميائية.
تم حساب التنقل في علامة الصبغة Weber and Osborne (1969) على النحو التالي: التنقل = مسافة انتقال البروتين بعد طول الصبغة قبل صبغ صبغة الهجرة ، ثم يتم رسم التنقل مقابل الأوزان الجزيئية المعروفة المعبر عنها في مقياس شبه لوغاريتمي. o إذا كان من الممكن تحديد الوحدة الفرعية لبروتين غير معروف من المنحنى القياسي (الشكل 5 ، أعلى اليمين).
قد تكون هناك حاجة إلى سترة لتبديد الحرارة الزائدة المتولدة. تظهر علاقة تقريبية بين تركيز مادة الأكريلاميد (مونومر) ونطاق الأوزان الجزيئية للوحدة الفرعية التي يمكن فصلها مع تركيز مادة الأكريلاميد في وجود جزيئات SDS. يمكن أيضًا استخدام تأثير محدد على هذه النطاقات للتحكم في الحركات (الميوسين القلبي) تم الحصول عليه.
208 Myosin Gel HC LC’s Quantity EC 0 u) u) E 0 QVC 0 Y 0 Q n 0 LL f المسافة على طول Ge 5 – lo pg بروتين الشكل 5 تمثيل تخطيطي للمعلومات الكمية والنوعية التي يمكن الحصول عليها بواسطة SDS-PAGE A t الجانب العلوي الأيسر هو عبارة عن هلام ميوسين عتبة يظهر سلاسل ثقيلة وخفيفة من الميومين القلبي مفصولة بالحجم.
تم رسم مخطط مسح قياس الكثافة لهلام الميوسين في الجزء الأيسر السفلي من الوزن الجزيئي للوحدة الفرعية مقابل الحركة في الجزء العلوي الأيمن. المكون الأيمن السفلي هو منحنى قياسي يتم الحصول عليه عن طريق الرحلان الكهربائي ومسح سلاسل مختلفة ، ولكن يمكن استخدام كميات صغيرة من البروتين المنقى في المنحنى القياسي لقياس كمية هذا المكون في خليط العينة (على سبيل المثال ، كمية الأكتين – الأميوفيبريل) التي تحتوي على كمية غير معروفة. ، مستخدمة. بروتين
11 TABm V العلاقة التقريبية بين تركيز BETWFEN الأكريلاميد و MW لقنوات بولي ببتيد مفصولة بواسطة الرحلان الكهربي SDS-polyacrylamide. 5 ، أعلى اليسار) وتم مسحها ضوئيًا باستخدام مقياس كثافة (الشكل 5 ، أسفل اليسار). يظهر مخطط للوزن الجزيئي مقابل التنقل في الشكل 5 ، أعلى اليمين. يجب استخدام جزيء وحدة فرعية مختزل جيدًا لعمل مثل هذه الحالة . يمكن استخدام المنحنى القياسي لجداول الأوزان الجزيئية للبروتينات ووحدات البروتين الفرعية التي تم تجميعها بواسطة Darnall and Klotz (1972) لتحديد الوزن الجزيئي للبروتينات القياسية بسهولة عن طريق حساب المنطقة الواقعة تحت تتبع قياس الكثافة لفرقة بروتين معينة وتخطيط هذه القيمة ضد ص. محملة (يتم ذلك عادةً عن طريق الرحلان الكهربائي ومسح سلسلة من كميات مختلفة ، ولكن معروفة ، من البروتين عالي النقاء (انظر الشكل 6) ، يمكن رسم منحنى قياسي كما هو موضح في أسفل يمين الشكل 5.
بعد ذلك ، يمكن فصل خليط عينة يحتوي على كمية غير معروفة من هذا المكون وفحصها بالكهرباء. منحنى vsmobility القياسي في الجزء العلوي الأيمن من الشكل 5 ، ويمكن تحديد كمية هذا المكون البروتين في العينة الأصلية من منحنى قياسي مثل ذلك الموضح في الجزء السفلي الأيمن من الشكل 5.
يجب أخذ القياس الكمي في الاعتبار من خلال شحن البروتينات الفردية ، ويستخدم الآن عدد من تقنيات تلطيخ البروتين في الكشف عن الأيونات على نطاق واسع في الدراسات الكمية (Watkh and M iller، 1970؛ Fishbein، 1972؛ Dattiner and Finnimore، 1973؛ Rakusen، 1973؛ P قضاعة ، 1974) يرجع الاستخدام الواسع والتنوع لـ SDS-PAGE بشكل أساسي إلى قدرة SDS ، وهو منظف أنيوني ، على إذابة مجموعة واسعة من عضيات الخلايا غير القابلة للذوبان بشكل طبيعي ، مثل الأغشية والألياف. بالإضافة إلى حل مشاكل مكونات ومكونات فراشات ماكلين.
استخدموا SDS-PAGE بشكل فعال في عملهم الدقيق على التركيب البروتيني لشبكة الهيولى العضلية ودراساتهم حول خصائص البروتينات الشبكية الساركوبلازمية المنقى (Macknan، 1974؛ Ostwald and MElcLennan، 1974؛ Stewart and Macnnan). سابقًا كان SDS-PAGE أبطأ بكثير
210 PROTEN LCAUE3 r! 3 ‘؟ 06-1d 74 4c ow – الشكل 6 تم تحميل الرحلان الكهربائي SDS-polyacrylamide للهيكل العظمي الخنازير – الأكتينين A llgelsare 7 polyacrylamide 1 $ 2 $ مع كميات مختلفة ولكن معروفة من a-actinin التي تم تحديدها في إجراء جراحي.
يتم بعد ذلك استخدام هذه المعلومات لكل هلام لإنشاء منحنى قياسي للقياس كما هو موضح بشكل تخطيطي في الشكل 5 ، أسفل اليمين.
يستخدم 13 211 SDS-PAGE بشكل متزايد لدراسة البروتينات العضلية الليفية العضلية Sender (1971) وكان Scopes and Penny (1971) من بين أول من قام بإذابة اللييفات العضلية السليمة المعزولة في SDS ، وكانت العينات SDS-PAGE ووضعت shm.
أن البروتينات الليفية العضلية الرئيسية يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال حركتها ، وبالتالي فإن وزنها الجزيئي بوتر (1974) استخدم مؤخرًا SDS-PAGE متبوعًا بتقدير دقيق
لتوضيح أن النسب المولية التقريبية للبروتينات العضلية الليفية الرئيسية في العضلات الهيكلية للأرانب هي: أكتين: ميوسين: تروبوسيتوسين: تروبونين T: تروبونين: تروبونين C = 7: l: l: l: l: من الواضح أن SDS-PAGE هو أداة قوية لدراسة بيولوجيا العضلات وعلوم اللحوم. في المجالات البيولوجية الأخرى. تم اختيار الأمثلة التالية من مختبرنا الخاص لتوضيح بعض تطبيقات PAGE في بيولوجيا العضلات وبحوث علوم اللحوم. بدلاً من ذلك ، سيكون الهدف في كل مثال هو وصف نوع المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال PAGE مقارنة الأكتينين α من عضلات مختلفة في تكوين نوع t-fiber.
أظهر أن التغيير الهيكلي الرئيسي الذي لوحظ أثناء تخزين العضلات بعد الوفاة هو التفكك التدريجي للخط Z (Goll et al ، 1971 ؛ 1974). على الرغم من أن التركيب الكامل لهيكل الخط Z غير معروف ، فقد أظهرنا أنه في على الأقل جزئيًا ، يتكون من بروتين أ-أكتينين (Goll- وآخرون ، 1969 ؛ Robson – وآخرون * a1 ، 1970 ؛ Schollmeyer et al ، 1973 ؛ Stromer – et a1 ، 1969) كما تم الإبلاغ عن عرض يمكن أن يكون الخط Z كأحد المعايير المستخدمة للتمييز بين أنواع الألياف (Gauthier ، 1969) هي خطوط Z للألياف الحمراء.
في العضلات الهيكلية للثدييات ، يبلغ عرضه ضعف عرض الألياف البيضاء تقريبًا ، مع عرض خطوط Z للألياف الوسيطة بين الألياف الحمراء والبيضاء (Gauthier ، 1970 ؛ Suzuki et al ، 1973).
قد ترجع بنية الخط (وبالتالي ، بعض الاختلافات في سلوك ما بعد الوفاة بين العضلات التي تختلف في تكوين نوع الألياف) جزئيًا إلى الخصائص المميزة للأكتينين ألفا. المقاطع المظلمة من عضلات الخنازير النصفية (Robson and Zeiss ، 1973 ؛ Suzuki et al. ، 1973). أظهر الأكتينين المحضر من ثلاثة مصادر عضلية مختلفة في هذه الدراسات أن الأكتينين ألفا القلب ظهر كحزمة (متجانسة) ، في حين أن معظم الهيكل العظمي
14212 لوب Ot ael slab J erface CDL الشكل. 7 الرحلان الكهربي للهلام بولي أكريلاميد (بدون SDS) من الأكتينين بعد التنقية بواسطة عمودين من السليلوز DEAE ، كان تركيز الأكريلاميد بنسبة 4 ٪ أكثر من 6 دولارات حيث كان سطح الواجهة لكل المادة المطبقة يظهر البروتين جيدًا في الشكل. كان thegelslab 30 بيكوغرام. العينات C (القلب) ، D (الهيكل العظمي الداكن) ، و L (الهيكل العظمي الخفيف) كانت α-actinins مأخوذة من الشكل 3 في Robson and Zeece (1973) بإذن من Elsevier Scientific Publishing Co ، أمستردام. انظر المصدر إلى يضيف ظروف تجريبية
هاجر الأكتينين من القلب كحزمة متميزة ذات حركة أبطأ.
كانت الفرقة المقابلة للقلب أ – الأكتينين هي الأبطأ من بين العصابات الثلاثة في الهيكل العظمي المظلم – الأكتينين تطابق تمامًا النطاق الرئيسي من الهيكل العظمي الخفيف – الأكتينين كما هو متوقع لأن عينة العضلات الأصلية تحتوي على بعض الألياف البيضاء. قد يمثل النطاق الأوسط نوعًا من جزيء الأكتين. يوضح الرسم البياني الكهربائي لثلاثة أكتينات من الخنازير الموضحة في الشكل 8 أن جميع الأكتينينات الثلاثة تهاجر كحزمة واحدة على SDS-PAGE ، ولا يوجد فرق كبير في هجرة الخطيئة ،
وهكذا ، لوحظ حجم الوحدات الفرعية teA-actinin بين عينات الخنازير الثلاثة عند إجرائها في تجاويف اختبار معملية مجاورة. تم تحديد الأوزان الجزيئية للوحدات الفرعية بعلامات مناسبة وتم الحصول على قيمة تقارب 95000 لجميع الأكتينينات الثلاثة (الشكل 9). وهكذا ، في حين أن نتائج PAGE التي أجريت في غياب SDS (أثبتتها دراسات كيميائية حيوية أخرى) أظهرت فروقًا ذات دلالة إحصائية بين الأكتينين ، أظهرت نتائج SDS-PAGE أن هذه الأكتينين لم تختلف بين الجزيئات الأولية. استنتجوا أن الأكتينين القلبي والجزء الأكبر من الأكتينين من العضلات الهيكلية الداكنة متشابهان ، إن لم يكن متطابقًا ، لكن كلاهما يختلف اختلافًا كبيرًا في الخصائص الجزيئية المحددة عن الجزء الأكبر من الأكتينين المعزول من العضلات الهيكلية الخفيفة لتحديده. سيكون من المثير للاهتمام معرفة ما إذا كانت هذه الاختلافات مختلفة.
الأكتينين مسؤول عن بنية الخط Z لأنواع مختلفة من الألياف وما إذا كانت مسؤولة عن تغييرات ما بعد الوفاة في سلامة اللييفات العضلية (Dutson et al ، 1974) والبروتينات الليفية الداخلية (Hay et al ، 1973). يتم عزل العضلات من نوع الألياف.
تنقية Caz + العامل المنشط (CAF3) المسؤول عن فقدان خطوط Z بعد الوفاة تشير الدراسات الحديثة في المختبر (Busch et al ، 1972a ؛ 1972b ؛ Go11 و 1971 ؛ 1974) إلى أن التغييرات الهيكلية بعد الوفاة في اللييفات العضلية العضلية. نتيجة للبروتياز النشط Caz + الموجود في سيتوبلازم الخلية العضلية.
يتمتع هذا الإنزيم بقدرة ملحوظة على إزالة خطوط Z وقد يتسبب أيضًا في حدوث انقسام محدود في الخط M. واستطالة الأورام اللحمية المختصرة بشكل صارم عن طريق الانقسام المحلل للبروتين المحدود (Go11 et al. ، 1974 ؛ Stromer et al. ، 195) تمت الآن تنقية هذا الإنزيم بنجاح ، وتمت دراسة آثاره على تحلل البروتينات الليفية لمدة 49 يومًا. *،أ؛ دايتون وآخرون (غير منشور)
L ج الشكل 8 الرحلان الكهربائي للهلام SDS-polyacrylamide
الأكتين بعد التنقية بواسطة عمودين DE و بولي أكريلاميد السليلوز المحتوي على 5٪ أكريلاميد ونسبة 40: 1 (وزن / وزن) أكريلاميد-أكريلاميد تاكروكروميد. كانت البروتينات المستخدمة في كل بئر عبارة عن عينات C (للقلب) و D (هيكل عظمي غامق) و L (هيكل عظمي خفيف) α-actinin ، مأخوذة من الشكل 5 في Robson and Zeece (1973) بإذن من Elsevier Scientific Publishing Co ، أمستردام. . مرجع شروط الاختبار الإضافية
17 الفوسفور كالفوسفات ديهيدروجينيز كيموتريبسينوجين A 1 0 i Mobi i ty (مم) الشكل 9 تحديد الوزن الجزيئي لسلسلة بولي ببتيد الأكتينين الهيكلية الخفيفة من خلال مقارنة حركتها ببروتينات الواسمات في فتحات البئر المجاورة في الرحلان الكهربائي الهلامي SDS أكريلاميد مستنسخ من الشكل 6 في Robson and Rees (1973) بإذن من Elsevier Scientific Publishing Co. ، أمستردام
216 التجميع المستخدمة في MOUNT CAF PURFCATON TABLE V
التحديد 1 Z – D هو إزالة k معدل إزالة ctivity 2 للقرص Z من اللييفات العضلية عن طريق الفحص في مجهر الطور – القدرة على إذابة اللييف العضلي P بروتين 3 A bilyto Hydrolyze – تحديد معدل إطلاق مواد الببتيد القابلة للذوبان في 100 مم KC 1 frm myofibrils تحديد معدل إطلاق المواد القابلة للذوبان TCA من الكازين بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام في S odim Dodecyl S sulfate 5 polyacrylamide gel electrophoresis في Tris ediethy ~ ~ ~ PH ~ ~ ~ ~ ~ PH biturate TABU3 VS ~~~~ ~ CHROMATOGRAPHC PURFCATON CAF 1 6٪ عمود Agarose – CAF Elutes 2 عمود DEAE-Cellulose – CAF Elutes 3 Sephadex G-200 Column – CAF Elutes – Dete 3-4 أضعاف النشاط يزيد بمقدار 3 مرات و 300 ملم KC
زيادة 1-10 أضعاف في عدم الخصوصية في مقايسة الكازين – وهذا الأخير هو زيادة 3-4 أضعاف في الخصوصية في مقايسة الكازين. 235 و 260 ملي مولار KC 1 – L5-2 يزيد من عدم الخصوصية في اختبار الكازين يسرد الجدول V المقايسات المستخدمة لمراقبة تنقية CAF PAGE في الوجود (# 4 في الجدول V1) والغياب (# 5 في الجدول V) أستخدم. يشكل SDS اثنين من المعايير الخمسة المستخدمة. يرد ملخص لخطوات التنقية الكروماتوغرافية الأربع المستخدمة كجزء من تنقية CAF في الجدول الخامس ، نتائج SDS-PAGE.
10 SDS-polyacrylamide الكهربائي للهلام
تم تحميل 19 شظية نشطة تم الحصول عليها أثناء التنقية الكروماتوجرافية لخام Po-40 CAF A llgelsare 7 ٪ أكريلاميد جل Po-40 مع 30 بيكوغرام من البروتين. تم تحميل جميع المواد الهلامية المتبقية بـ 22 بيكوغرام من البروتين. 11 SDS-polyacrylamide الكهربائي للهلام الكهربائي للعضلات الهيكلية الخنازير التي تحتوي على C-pro قبل وبعد علاج CAF G عينات إلسا وعينات التحكم حيث تم استخدام EDTA لربط أي أثر لـ Ca2 ′ لمنع CAF الهلامات b و d المضافة إلى الميوسين و C- البروتين بعد 60 دقيقة من الحضانة مع CAF عند 25 درجة مئوية في وسط يحتوي على 7 ٪ من هلام الأكريلاميد و l @ في مم يشير CaCl2 إلى HC = السلسلة الثقيلة أو الوحدات الفرعية myos DTNB و A-2 = الوحدات الفرعية الخفيفة للميوسين هي – _ (الأعشاب- an – 3-
أب ج التعريف 12 الرحلان الكهربائي للهلام SDS-polyacrylamide
الشكل 13 الرحلان الكهربي للهلام SDS-polyacrylamide هلام الرحلان الكهربائي للعضلات الهيكلية للخنازير تروبونين والعضلات الهيكلية تروبوميوسين راتينج فردي قبل وبعد الوحدات الفرعية للتروبونين A llgelsare 7 ٪ أكريلاميد أكريلاميد وأكريلاميد F6. TN = جل تروبونين T الأصلي ، عينة تحكم تمت إضافة EDTA فيها. تم تحميل 7 بيكوغرام فقط من التروبوميوسين بواسطة كرونوغراف DEAE-cellulose في الجهاز الحالي لحل وحدتين فرعيتين من 6 M من هلام اليوريا TN مع 20 بيكوغرام من مادة الهلام التروبوميوسين الهيكلية c و d ، مما يشير إلى أن التروبوغل محمل بـ T 7s. تروبونينوسين بعد 60 دقيقة من الحضانة أن CAF عند 25 درجة مئوية و تروبونين على التوالي . تم تحميل C-gel بوسط يحتوي على 5 ملي مولار من CaCl و CAF إلى تروبوميوسين ، 15 بيكوغرام من التروبونين-ج ، 1: 200 بالوزن. تم تحميل الجل بـ 25 ميكروجرام من الأوتين والجيل بـ 7 ميكروجرام من البروتين. جل يحتوي على 25 بيكوغرام من التروبوميوسين والهلام محمل بـ 7 بيكوغرام من التروبوميوسين
21 أب ج يوم بعد الذبح 230،000- locj، 000- TN-T-mni، 00034،000- TN – TN – C- re 14 SDS-polyacrylamide الكهربائي للراتنج التروبوني للعضلات الهيكلية وبعد العلاج A 16 بولي أكريلاميد غوي تم تحميل -5 ميكروجرام من البروتين على كل جل EL وتم عرض 2 عناصر تحكم حيث تمت إزالة EDTA قبل CAF Gel elb تروبونين بعد 60 E عند 25 درجة مئوية في وسط حضانة مع C يحتوي على 5 مم CaC٪ عروض. تُظهر نسبة CAF إلى تروبونين 200 بالوزن هلام د أن التروبونين يُعامل على أنه هلام ونسبة تروبونين بوتاتا CAF t E بالوزن 1: 2000 الشكل 15 SDS-polyacrylamide الكهربائي للهلام العضلي الليفي المحضر من عضلات الهيكل العظمي البقري 6 أكريلاميد. تشريح الجثة بعد الوفاة CA lgelsare 1 بيكوغرام من البروتين المحمّل على كل جل F Olson و DG و FCP arrish ، غير منشور
تم إجراء الاختبار على عينة محملة
(P0،4o = جزء الترسيب لكبريتات الأمونيوم من مستخلص الساركوبلازم القابل للذوبان بين الرقم الهيدروجيني 49 و 62) يظهر في العمود الأول جنبًا إلى جنب مع البروتين الأكثر نشاطًا الذي تم غسله من كل عمود لاحق في الشكل 10. يتم عرض Po-40 في وقت مبكر. العينة غير متجانسة إلى حد كبير ، ولكن بعد العمود الرابع ، ينتقل البروتين في المواد الهلامية SDS إلى ثلاثة مكونات للأوزان الجزيئية 80.000 و 60.000 و 30.000 دالتون.
يُظهر التنقية الكروماتوجرافي الهلامي الإضافي SDS-polyacrylamide الكثافة أن 80.000 و 30.000 من مكونات الوزن الجزيئي الفرعي موجودة بنسب مولارية متساوية. جزيء دالتون CRF – نظرًا لأن CAF هو أول إنزيم محلل للبروتين داخلي للعضلات قادر على هضم الأكتوموفيبريلس (Busch etal ، 1972 أ) ، دراسات حول قدرة CAF على تحلل بروتينات الفيبريل الخاصة بها ، الميوسين ، البروتين C ، ألفا أكتينين ، الأكتين ، التروبوميوسين والتروبونين أجريت.
عن طريق احتضان CAF بالبروتين العضلي الليفي المنقى لمدة 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية في وجود 5 ملي مولار من الكالسيوم. تم إيقاف عمل CAF عن طريق إضافة EDTA إلى تركيز نهائي قدره 10 ملي EDTA. على كتلة السلاسل الثقيلة أو الخفيفة من الميوسين (الشكل 11) ، يكون هذا مفاجئًا لأن الميوسين يتحلل بسرعة بواسطة مجموعة متنوعة من الإنزيمات المحللة للبروتين.
مشقوق بواسطة سلسلة CAF إلى سلسلة ببتيدية بكتلة أقل قليلاً من سلسلة ببتيد CAF الأصلية للبروتين C ، المكسرات النقية. ra-actinin هذه النتيجة غير متوقعة لأن a-actinin موجود في 2-line ، a-actinin يرتبط بالأكتينين في المختبر ( Go11 et al ، 1972 ؛ Robsm etal ، 1970) و CAFs تكسر خطوط Z – على الرغم من أن myosin CAFs ، لا يكسر الأكتين ura-actinin ، بل يكسر التروبوميوسين (الشكل 12) والتروبونين (الشكل 14) CAF يقسم التروبوميوسين إلى مجموعة من الأجزاء الجزيئية.
الأوزان التي تتراوح من 13000 إلى L8 ، ooo daltons ، مجموعة من الشظايا الأصغر (الشكل 12 ، هلام و د) يوضح الشكل 13 (TN gel) مثالًا على تروبونين الهيكل العظمي للخنازير المنقى المستخدم في دراسات الهضم بواسطة المواد الهلامية CAF T و C تم استخدام الشكل 13.
أمثلة لوحدات التروبونين الفردية (Grieser and Gergley ، 1973) التي عزلناها بواسطة كروماتوغرافيا السليلوز DW في وجود 6 M من اليوريا. بوزن 1: 2000 يظهر أن تروبونين يتحلل قبل تروبونين (الشكل 14 ، هلام و د) من الواضح أن SDS-PAGE كانت تقنية مفيدة للغاية في دراسة تنقية CAF وتقييم قدرتها على التدهور على وجه التحديد. تنقية البروتينات العضلية الليفية
إن تأثير تخزين ما بعد الوفاة على بروتينات M yofibrillar التي يمكن استخدام SDS-PAGE لدراسة الألياف الحقيقية يجعلها طريقة حساسة للغاية ومناسبة للكشف عن تحلل البروتين بعد الوفاة.
الدورات الزمنية بعد الوفاة (Olson و DG و FCP Reach ، غير منشورة) على الرغم من أن هذه الدراسات لم تكتمل بعد ، فإن النتائج الواردة في الشكل 15 تشير إلى بعض فقدان تروبونين تي (النطاق M فوق تروبوميكسيري المزدوج عند 34000 دالتون) في طول التخزين بعد الموت هو A.
يُلاحظ وزن جزيئي يبلغ حوالي 30000 دالتون في عينات العضلات المسنة ، حيث يمكن الحصول على تغييرات مماثلة من خلال علاج اللييفات العضلية ليوم الصفر باستخدام CAF ، مما يدعم الاقتراح بأن CAF مسؤول عن الكثير من تدهور ما بعد الوفاة. ) C ONC U SONS على الرغم من أن هذه المراجعة تقتصر على مناقشة استخدام PAGE (مع وبدون SDS) ، فمن خلال دراسة 33 بروتينًا ، يجب أن تكون فائدة دراسات PAGE في بيولوجيا العضلات وأبحاث علوم اللحوم واضحة. تقنية قوية لها نطاق واسع قابلية التطبيق على المشكلات في كل من المجالات الأساسية والتطبيقية ، نأمل أن يؤدي هذا الاتصال إلى زيادة استخدام PAGE. من قبل أولئك الذين ليسوا على دراية بهذه التقنية بعد ،
نعترف بجوان أندرسون وباربرا هومان لمساعدتهما في هذه المخطوطة للسماح للدكتور فريد سي بي أريش وطلابه ، دينيس جيه أولسون وسي إس تشينج ، بتقديم بعض أعمالهم في اجتماع RMC. كما نشكر ماري بريمر وجايك هارفي ودارلين ماركلي على المساعدة الفنية المتخصصة
24222 LTERATURE CTED Busch، WA، DE Go11 and FCP arrish، Jr 1972a الخصائص الجزيئية لنمو توتر العضلات بعد الوفاة وفقدان العضلات في الأبقار والخنازير والأرانب J Food S ci 37: 289 Busch، WA، MH Stromer، DE Go11 Suzuki 1972b كاليفورنيا 2
إزالة محددة لخطوط Z من العضلات الهيكلية للأرانب JC ell B iol 52: 367 Chrambach، A and D Science 172: 440 Rodbard 1971 Polyacrylamide هلام الكهربائي Darnall، DW and M Klotz rodnichreed 19 Biochem Biophys 149: 1 Datyner، A and ED Finnimore 1973 طريقة مسجلة للتقدير الكمي للبروتينات على هلام بولي أكريلاميد Anal Biochem 55: 479 Davis، BJ 1964
الرحلان الكهربائي للقرص 11 طريقة وتطبيقات لبروتينات المصل 1
and NY2، S41 WR، DEG oll، WJR eville، MG Zeece، MH Stromer، and RM Robson 1974 P urification وبعض خصائص إنزيم العضلات الذي يحط من الألياف العضلية Fed Proc 33: 1580 Dayton، WR، DEG oll، MH Stromer، WJ Reville ، MG Zeee ، RM Robson 19 75 بعض خصائص البروتياز النشط Caz + الذي قد يكون متورطًا في دوران البروتين العضلي الليفي. : 5074 Dutson، TR، AM Pearson، RA Merkel and GC Spink 1974 U التغيرات الهيكلية بعد الوفاة في ألياف عضلات الخنازير العادية والمنخفضة الجودة J Food S ci 39:32 Fishbein، WN 1972 القياس الكمي للكثافة من 1-50 بروتين هلامي من 1 إلى 50 أزرق بروتين لام CQ. Anal Biochem 46: 388 F lorini و JR و RPB rivio 1969 الرحلان الكهربائي للقرص لمشتقات الميوسين والميوسين ، هلام بولي أكريلاميد المخفف Anal Biochem 30: 358 F lorini و JR و RP Brivio و BA MB attelle 1973 بروتينات أخرى NY Acad. S ci 2O9: 299
25 Gauthier، GF 1969 حول العلاقة 3f ميزات البنية التحتية والكيميائية الخلوية للتلوين في العضلات الهيكلية للثدييات ZZ، ellforsch 95: 462 Gauthier، GF 1970 البنية التحتية لثلاثة أنواع من الألياف في العضلات الهيكلية للأمهات N: فسيولوجيا العضلات 11 المساعد (Briskey ، EJ ، RG Cassens، and BB Marsh، ei University of Wisconsin Press، Madison Goll، DE، WFHM Mommaerts، MK Reedy and K Seraydarian 1969 دراسات حول البروتينات الشبيهة بالأكتينين التي تم إطلاقها أثناء هضم التربسين للأكتينين و myofibrils Biochim Biophys Acta 175: 174 Goll ، DE ، MH Stromer ، DG Olson ، WR Dayton ، A Suzuki and RM Robson 1974 دور البروتينات العضلية الليفية في حنان اللحوم Proc Meat nd Res Conf (n press) Goll ، DE ، MH Stromer ، RM Robson ، J Temple ، BA Eason and WA Busch 1971 الهضم التجريبي لمكونات العضلات العديد من التغييرات الناتجة عن تخزين ما بعد الوفاة J له Sci 33: 963 Goll و DE و A Suzuki و J Temple و GR
توقف هولمز 1972 عن الدراسات حول أ- المنقى. تأثير الأكتينين لدرجات حرارة التروبوميوسين على تفاعل أ-أكتينين / ف-أكتين J Mol Biol 67: 469 Gordon، AH 1969 الرحلان الكهربائي للبروتينات في بولي أكريلاميد ونشا N الهلام: التقنيات المختبرية في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية (العمل ، TS و E) ، pp American Elsevier Publishing Co، nc، New York Greaser، ML and J Gergely 1973 تنقية وخصائص مكونات تروبمين J Biol Chem 248: 2l25 Hay، JD، RW Currie and FH Wolfe 1973 قرص بولي أكريلاميد والهلام الكهربي الطازج بروتينات الفرخ m kle في كبريتات دوديسيل الصوديوم J Food Sei 38: 937 Laemmli ، المملكة المتحدة 1970 انقسام البروتينات الهيكلية أثناء التجميع الرئيسي للعاثية T4 Nature 227: 68O MacLennan ، DH 1974 عزل الشكل الثاني من Ccalehem 249: الرحلان الكهربائي للقرص والتقنيات ذات الصلة Maurer ، polyacrylamide gel electrophoresis HR Walter de Gruyter، New York Neville، DM، Jr 1971 تحديد الوزن الجزيئي لمجمعات البروتين دوديسيل كبريتات بواسطة الرحلان الكهربي للهلام في نظام عازلة غير مكتمل J Biol Chem 246: 6328 Ornstein، L 1964 القرص الكهربائي الخلفية والنظرية آن. نيويورك علوم أكاد Ul: 32l
224 Ostwald، TJ and DH Macknnan 1974 solatimofa بروتين مرتبط بالكالسيوم عالي التقارب من الشبكة الساركوبلازمية JB id Chem 249: 974 Peterson، RF 1971 اختبار لنقاء البروتينات بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام 197D ، محتوى هلام 197D.
، الأكتين والميوسين من اللييفات العضلية الهيكلية للأرانب Arch Biochem Biophys 162: 436 Racusen ، D 1973 Stoichiometry لتفاعل amido الأسود مع البروتين Anal Biochem 52:96 Raymond، S and L Weintraub 1959 Reymond، S and L Weintraub 1959 Reymond، S and L Weintraub، 1959 Reymond، S and L. JA and C Tanford 1970 التركيب الإجمالي لمجمعات كبريتات PMtein-sodium dodecyl sulfate JB iol Shem 245: 5161 R ighetti، PG and JW Drysdale 1973 تجزئة صغيرة للبروتينات وأحماض الأميد النووية بواسطة جيلاتين متساوي الكهربي. من عضلات القلب والهيكل العظمي Biochim Biophys Acta 295: 209 Schollmeyer و JE و DE Goll و RM Robson و MH Stromer 1973 توطين الأكتينين في العضلات الهيكلية و iol 59: 306a Scopes ، RK and F Penny 1971 أحجام الوحدات الفرعية لبروتينات العضلات تم تحديده بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم Biochim Biophys Acta 236: 409 Sender ، PM FEBS L ett 1971 ، ليفات العضلات: جل جل ، جل 17 ، 17 ، 17 ، 1971 ، جل ، جل وألياف عضلية. Vinuela and JV Maizel 1967 تقدير الوزن الجزيئي لسلاسل البولي ببتيد بواسطة هلام الرحلان الكهربي SDS-polyacrylamide. الجسيمات السطحية لأغشية الشبكة الساركوبلازمية السمات الهيكلية للأدينوسين ثلاثي الفوسفاتيز JB id Chem 249 ~ 9 8 5