199 پلی آکریل ژل الکتروفورس N TKE وجود و msmcz حلالهای دناتورپیگ~، ~ RCHARD M ROBSON، LB TABATABA، WR DAYTON، MG ZEECE، DE GOU، و MH STROMER هر دو دارای ژل گسترده ایالتی الکترومغناطیسی هستند. یک تحقیق و یک tdol تشخیصی از زمان معرفی آن چندین سال پیش (ریموند و واینتراب، 1959؛ دیویس، 1964؛ اورنشتاین، 1964) این تکنیک به طور مستمر دستخوش اصلاح و بهبود بوده است و وعده می دهد که در آینده مفید باشد.
برخی از پیشزمینهها و مفاهیم زیربنای PAGE تغییرات زیادی در روش تحقیق وجود دارد، اما این مقاله به بحث در مورد الکتروفورز دیسک معمولی محدود میشود، که اغلب به عنوان روش Ornstein-Davis از آن یاد میشود (Ornstein, 1964; Davis, 1). 4 دلار)، و به استفاده اخیر توسعه یافته از PAGE که در حضور شوینده آنیونی، سدیم دودسیل سولفات (SDS3) انجام شد، اگرچه موضوع این مقاله با استفاده از ژل های پلی آکریل آمید در الکتروفورز ناحیه، ژل های پلی آکریل آمید نیز برای تمرکز ایزوالکتریک پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک مفید هستند (Florini et al, 1973; ریگتی و دریسدیل، 1973; ولنر و هیز،
و در ایزوتااکوفورزیس (Svendsen, 1973) پس از بررسی مختصر PAGE، سودمندی این روش با بحث در مورد چندین مشکل تحقیقاتی از آزمایشگاه ما نشان داده خواهد شد، اگرچه PAGE اغلب در مطالعات اسیدهای نوکلئیک و سایر ماکرومولکول های باردار استفاده می شود. نمونههای انتخابشده همگی به استفاده از آن در جداسازی پروتئینها مربوط میشوند، امید است که این نمونهها استفاده از این تکنیک را بهطور خاص برای تحقیقات زیستشناسی عضلانی و علوم گوشت بازگو کند.
محصول نهایی پلیمریزاسیون و اتصال عرضی مونومر، آکریل آمید، و کومونومر پیوند متقابل، N,N1-متیلن-بیس آکریل آمید (اغلب به سادگی به عنوان “Bis” شناخته می شود) نشان داده شده است. ایستگاه آزمایش اقتصاد، پروژههای ایمز، اوا 1796 و 2025 مطالعات اولیه گزارششده در این بررسی تا حدی توسط کمکهای مالی از طرف ملی پشتیبانی شد. nstitutes of Health (HL و AM 12654)، انجمن های دیستروفی عضلانی آمریکا و انجمن قلب owa ارائه شده در بیست و هفتمین کنفرانس گوشت متقابل انجمن علوم گوشت آمریکا، اختصارات استفاده شده در این مقاله: PAGE، الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید. SDS، سدیم دودسیل سولفات؛ CAF، Ca2+-activated factor
200 N، N’-متیلن-بیس-اکریلارنید (Bis) آکریل آمید (مونومر) CH2=CH c=o NH2 + نیتاتورها 3 CH2=CH C=O NH + FH2 NH F=O شکل 1 واکنش پلیمریزاسیون آکریل آمید متقاطع – مرکب پویا کرای آمید
3 201 co co co NH – co -C H2 -CH [C H2-C H 3 XC H2-C H – [C H2-fH -1 xc H21 CO co NH NH2 co NH2 CH2 NH co -C H2-C H – [C H2-C H-3 1 co XC H2-C H – [C H2-C H – xc H2 co CQ شکل 2 ساختار ژل پلی آکریل آمید که زنجیره های بلند مونومر آکریل آمید پلیمریزه شده را نشان می دهد که توسط کومونومر به هم متصل شده اند، B است.
4 202-0-= پیوند متقاطع = پلیمرهای تصادفی -m-= = کویل های در حال رشد نقاط پیوند 111 = ساختار نهایی G el شکل 3 نمایش شماتیکی از واکنش پلیمریزاسیون منجر به ساختار سه بعدی ژل پلی آکریل آمید اقتباس شده از Maurer ( 1971) بافر بالایی حجم نمونه یا فاصلهدهنده (انباشته شدن) ژل جداسازی پروتئینها بافر پایین شکل 4 نمایش شماتیکی از تنظیمات آزمایشی پایه برای الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید
5 در شکل های 1 و 2 واکنش پلیمریزاسیون نیاز به افزودن یون آغازگر دارد (جدول 1) ترکیبی از پرسولفات آمونیوم و TW&D رایج ترین سیستم مورد استفاده برای پلیمریزاسیون شیمیایی است. قرار گرفتن در معرض اکسیژن مولکولی پلیمریزاسیون را در این سیستم نشان می دهد.
جدول 1 نمونه هایی از NTATOR های پلیمرزاتون (سیستم های کاتالیست-اکسیداکس) 1 پرسولفات آمونیوم [(NH4)2S208] و TENED 2 ریبوفلاوین و TEMED [N,N,N 1,N 1,N پلی اتیلن دی اتیلیکالیزاسیون رایگان] ژل های پلی آکریل آمید فرآیند کلی منجر به ساختار سه بعدی thegelis که به صورت شماتیک به تصویر کشیده شده است شکل 3 رشد زنجیره های پلی آکریل آمید با پلیمریزاسیون زینیل باعث تولید سیم پیچ های ژل پلیمری تصادفی می شود (مرحله 1) کویل های در حال رشد بسیار متمرکز می شوند
(مرحله 11 به صورت متقاطع و متقاطع) برای تشکیل ساختار شبکه مانند نهایی (مرحله 111) ویژگی فیزیکی مرتبط است s ژل (ویسکوزیته، الاستیسیته، چگالی و استحکام مکانیکی) با غلظت مونومر و کومونومر در محلول اصلی، درجه پلیمریزاسیون (طول زنجیره)، و درجه اتصال متقاطع که رخ میدهد تعیین میشود. شعاع منافذ متوسط غیر موثر تقریباً 05 تا 3 یا 4 نانومبی را به سادگی تنظیم غلظت کل آکریل آمید (کاهش تولید آکریل آمید با منافذ بزرگتر) و عامل اتصال متقابل (Chrambach and Rodbard, 1971) ارائه می کند. < 1000) و همچنین RNA با وزن مولکولی بسیار بالا (vlw > 10) نسبت وزن آکریل آمید به B است که نسبتاً بسیار کوچک است (< تقریباً اینجا)، ژل ها تمایل دارند بسیار شکننده و مات باشند،
از سوی دیگر، اگر نسبت وزن از حدود 100 بیشتر شود، ژل ها خمیری هستند و به راحتی شکسته می شوند، غلظت مونومر آکریل آمید تقریباً از 25 تا 3 و متغیر است و نسبت مونومر به B isis موجود است. با نسبت وزنی تقریباً 30 یا 40 به 1 در عمل عمومی، محلولهای ذخیره آکریل آمید و B با نسبتهای شناخته شده ساخته شده و برای استفاده راحت در یخچال نگهداری میشوند. در لوله شیشه ای (قالب orslab) و بین مخازن بافر بالایی و پایینی قرار می گیرد. نمونه معمولاً در محلول ساکارز یا گلیسرول 10 تا 5074 (برای افزایش چگالی) از قبل مخلوط می شود و در بالای سطح ژل اعمال می شود. یک میدان الکتریکی در سراسر ژل اعمال می شود، و
204 پیشرفت اجرا معمولاً با استفاده از یک رنگ ردیابی قابل مشاهده مانند برومفنول آبی کنترل می شود.
-روش دیویس)، یک ژل جداکننده (انباشته) با منافذ بزرگ معمولاً بالای ژل جداکننده با منافذ کوچکتر قرار می گیرد (شکل 4). نام “الکتروفورز دیسک” در اصل تا حدی از وابستگی این تکنیک به ناپیوستگی ها گرفته شده است. ماتریس الکتروفورتیک (Ornstein, 1964) الکتروفورز دیسک معمولی در جدول 11 خلاصه شده است. با این روش، سیستم جداسازی با توجه به مقدار ph، ترکیب بافر و اندازه منافذ ژل پلی آکریل آمید ناپیوسته است. این متغیرها به نوبه خود ولتاژ و ph ناپیوسته ایجاد می کنند. گرادیان ها قبل از جداسازی در ژل الک یا جداسازی (شکل 4)، این ناپیوستگی ها مناطق شروع بسیار باریک و متمرکز (باند) را در ژل انباشته ایجاد می کنند.
به قدرت تفکیک بالای الکتروفورز دیسک کمک می کند (به Ornstein، 1964، و Davis، 1964، برای توصیف کامل تر از انباشته شدن phemmenon مراجعه کنید) هنگامی که پروتئین ها وارد ژل جداسازی شدند، جداسازی پروتئین ها به بار الکتریکی خالص آنها (در واحد جرم) بستگی دارد. اندازه و شکل آنها در حین حرکت در منافذ ژل (الک مولکولی) جدول 11 رابطه تقریبی بین غلظت آکریل آمید و اندازه پرکرتئین هایی را که می توان در چنین ژلی جدا کرد، نشان می دهد. بسیار نامتقارن) ماکرومولکول ها و نسبت مونومر به Bis نیز از عوامل تعیین کننده مهم هستند. عملکرد تنظیم کننده ژل-کهلراوش (2) اثر شارژ الکتریکی – مولکول ها بر اساس بار الکتریکی خالص تقسیم می شوند 3) اثر غربال مولکولی – بر اساس اندازه مولکول (وزن مولکولی) و شکل
جدول 111 رابطه تقریبی بین غلظت آکریلامد و اندازه پروتئن ها BNG جدا شده توسط DSC E؛ ECTROPHORESS $ آکریل آمید (مونومر)
محدوده MW تقریبی 3 تا 7 a1,000,20,00-1,000,30,00,000-1,000,30,00,00,000-1,000,00,000-1,000,000 ترکیبی از درون بافر تحرک (به عنوان الکتروفورز آزاد) و محدودیت اعمال شده توسط ژل فیلتراسیون ژلهای تحرک الکتروفور ic را میتوان به شکل معادله M=qE f بیان کرد، که در آن M حرکت الکتروفورتیک بر حسب سانتیمتر بر ثانیه، بار قیستن بر روی میدان مولکول پروتئین است.
سانتی متر و ثابت اصطکاکی (Peterson, 1971) ثابت اصطکاکی، f، با ثابت، D، در محیط به واسطه آن ارتباط دارد. تحت شرایط الکتروفورتیک تعریف شده به شرطی که آزمایش های مختلف در شرایط یکسان انجام شود، می توان مقایسه مستقیم مهاجرت را انجام داد. فاصله ها برای بحث کامل تر در مورد اصول الکتروفورز به مورر (1971)، گوردون (1969)، اورنشتاین (4 دلار) و دیویس (1964) مراجعه کنید.
محلولهای بافری با قدرت یونی کم سرعت مهاجرت بالا را با تکامل کم گرما امکانپذیر میسازد، در حالی که بافرهای با قدرت یونی بالا، سرعتهای مهاجرت کم و افزایش قدرت یونی تولید گرما، مشکل بسیار دشواری را در الکتروفورز دیسک معمولی برخی از پروتئینهای اسکلتی پیش از ماهیچهها ایجاد میکند. لازم است تا ولتاژ کافی برای جداسازی الکتروفورتیک خوب وجود داشته باشد.
موفقیت بسیار محدودی با دیسالکتروفورز میوزین به دست آمده است، و تنها در صورت انجام در حضور wea (شرایطی که اهداف اصلی بسیاری از مطالعات الکتروفورتیک را نفی میکند) و wi. استفاده از ژل های پلی آکریل آمید بسیار رقیق (F lorini and Brivio, 1969) برخی مشکلات نیز با تروپومیوزین مشاهده شد که در قدرت های یونی پایین بسیار چسبناک است
و بنابراین تمایل به تجمع با بسیاری از بافرهای ترجیح داده شده دارد. استحکام یونی تقریباً صفر نگه داشته میشود، G-اکتین دچار مقداری pdymerization میشود (شاید تجمع کلمه بهتری باشد زیرا هیچ پیوند کووالانسی بین مونومرهای G-اکتین درگیر نیست) به F-اکتین بسیار چسبناک O از پروتئینهای میوفیبریلار، a – اکتینین دارای ویژگیهایی است (محلول کم است. و قدرتهای یونی متوسط) که به خوبی میتوانند با دیسالکتروفورز مطالعه شوند (Robson and Zeece, 1973; سوزوکی و همکاران، 1973)
206 TABLE V SDS-POLYACRYLAMDE GEL ELECTROPHORESS ساختار SDS = CH (CH2)loCH20S03Na+ توضیح یون (1) P roteinis دناتوره شده (زنجیره جدا )
تقریباً 14 گرم آنیون SDS متصل به هر گرم پروتئین، همه مولکولها را دارای بار منفی میکند (2) هر زنجیره پلیپپتیدی در ساختار میلهای گسترش یافته است. دهه 1960 (Shapiro etal, 1967) را به سختی می توان بیش از حد تخمین زد، زیرا یکی از معیارهای مفید بودن آن، وابستگی قبلی بسیاری از دانشمندان را به تجزیه تحلیلی فوق مرکزی به عنوان یکی از تکنیک های اولیه برای تعیین خلوص پروتئین در این تکنیک کاهش داده است.
محیط حاوی SDS (حدود 01 تا 16) و یا 2 مرکاپتواتانول ordithiothreitol برای کاهش و جلوگیری از پیوندهای دی سولفیدی جوشاندن به مدت 5 تا 10 دقیقه اغلب برای از بین بردن سریعتر خاصیت پروتئولیتیک پروتئازهای آلوده ترجیح داده میشود.
و آزبورن (l)، که یک سیستم پیوسته با توجه به بافر است. به عنوان افزایش غلظت آکریل آمید (دانکر و روکرت، 1969; Swank and Munkries، 1971)، استفاده از تکنیک discelectrophoreti c (Laenrmli، 1970؛ Neville، 1971)، و افزودن اوره به سیستم (Swank and Munkries، 1971)، برای بهبود جداسازی یا گسترش دامنه خطی وزنهای مولکولی (به تا واحدهای مهاجرتی در SDS-PAGE زنجیرههای مونومر هستند (یعنی aa ctinin با وزن مولکولی 200000 دالتون به شکل دو زیرواحد 100000 دالتون جدا شده مهاجرت میکند) Reynolds و Tanford (1970) نشان دادهاند که پروتئینهای مختلف مقادیر تقریباً یکسانی از SDS را در غلظتهای تعادل مونومر SDS بالای 05 میلیمتر با تعداد زیادی مولکول دودسیل سولفات با بار منفی متصل به زنجیره پروتئینی (V قابل تنظیم)، حتی اختلاف بار زیاد ذاتی پروتئینها (یعنی بار خالص ایجاد شده توسط گروههای یونیزهکننده زنجیره پلیپپتیدی به عنوان متمایز از
بار خالص کمپلکس پروتئین-sds) تقریباً از بین رفته است (دانکر و روکرت، 1969).
جدول S کمپلکس پروتئین-sds در SDS-PAGE به خوبی توسط Stoklosa و atz (1974) نشان داده شده است، که اخیراً روش ساده شده را گزارش کرده اند. برای SDS-PAGE که در آن از SDS فقط در محلول نمونه قبل از بارگذاری استفاده می شود، نه در محفظه های ژل یا الکترود. زنجیره پلی پپتیدی با SDS متصل دارای درجه بالایی از پارامترهای هیدرودینامیکی است که نشان می دهد این کمپلکس ذره ای قوس مانند است که طول آن به طور منحصر به فردی با مولکولی متفاوت است.
وزن بخش پروتئین این نتایج، همراه با نتایجی که مقدار ثابتی از SDS محدود شده در واحد جرم را فشار می دهند، مشاهدات تجربی انجام شده توسط Shapiro etal (1967) را توضیح می دهد که الکتروفورتیک متحرک ها با عملکرد منحصر به فرد ناحیه SDS-PAGE از وزن مولکولی خود ارتباط دارند. استفاده از این تکنیک پس از گزارش های بعدی وبر و آزبورن (1969) و دانکر و روکرت (1969) در اکثر علوم زیست شناسی رشد کرد. طیف گستردهای از پروتئینها با مشاهده Shapiro etal (l967) که اگر قابلیتهای الکتروفورتیک SDS در برابر لگاریتم وزنهای مولکولی زنجیره پلیپپتیدی شناخته شده ترسیم شود، منحنی صاف (که اساساً خطی بیش از محدوده MW مشخص وابسته به غلظت مونومر آکریل آمید است) نتیجه L است.
– در عمل عمومی، منحنی های استاندارد با استفاده از پروتئین ها تهیه می شوند (سه یا چهار می توانند روی asinglegel ترکیب و جدا شوند) دارای زیرواحدهایی با وزن های مولکولی کاملاً تعریف شده که قبلاً با روش های فیزیکوشیمیایی تعیین شده اند.
حرکت نشانگر رنگ، وبر و آزبورن (1969) تحرک را به این صورت محاسبه می کنند: تحرک = فاصله طول مهاجرت پروتئین پس از رنگ آمیزی طول قبل از رنگ آمیزی رنگ مهاجرت، سپس تحرک ها در برابر وزن های مولکولی شناخته شده بیان شده در مقیاس نیمه لگاریتمی ترسیم می شوند. o اگر زیر واحد یک پروتئین ناشناخته را می توان از روی منحنی استاندارد تعیین کرد (شکل 5 بالا سمت راست).
ژاکت، ممکن است برای دفع گرمای اضافی تولید شده مورد نیاز باشد. یک رابطه تقریبی بین غلظت آکریل آمید (مونومر) و محدوده وزنهای مولکولی زیرواحد قابل تفکیک با غلظت آکریلادئین در حضور SDS نشان داده شده است. یک اثر مشخص بر روی این محدوده ها و همچنین می تواند برای کنترل تحرک ها مورد استفاده قرار گیرد اگرچه تاکید بر این نکته بر جنبه های کیفی الکتروفورز بوده است، اطلاعات کمی را می توان همانطور که به صورت شماتیک در شکل 5 در مثال نشان داده شده (میوزین قلبی) نشان داده شده است، به دست آورد.
208 میوزین ژل HC LC’S کمیت EC 0 u) u) E 0 QVC 0 Y 0 Q n 0 LL f فاصله در امتداد Ge 5 – lo pg پروتئین شکل 5 نمایش شماتیک اطلاعات کمی و کیفی قابل دستیابی با SDS-PAGE A t بالا سمت چپ ژل میوزین آستاینه شده است که زنجیرههای سنگین و سبک میمین قلبی را نشان میدهد که بر اساس اندازه جدا شدهاند.
نمودار اسکن چگالی سنجی ژل میوزین در سمت چپ پایین گزارش وزن مولکولی زیر واحد در مقابل تحرک در سمت راست بالا ترسیم شده است. اجزای پایین سمت راست منحنی استانداردی است که با الکتروفورز و اسکن سریهای متفاوت به دست میآید، اما مقادیر کم پروتئین خالص شده منحنی استاندارد را میتوان برای اندازهگیری مقدار آن جزء موجود در مخلوط نمونه (به عنوان مثال، مقدار اکتینآمیوفیبریل) که حاوی مقدار نامعلومی است، استفاده کرد. پروتئین
11 TABm V رابطه تقریبی BETWFEN آکریل آمد کنسانتره و مگاوات کانال های پلی پپتدی که به وسیله الکتروفورس ژل SDS-پلی آکریل آمید جدا شده اند. 5، سمت چپ بالا) و با یک چگالی سنج اسکن شده است (شکل 5، سمت چپ پایین) نمودار وزن مولکولی در مقابل تحرک نشان داده شده است در شکل 5، بالا سمت راست، تمرین روتین، حداقل شش پروتئین هشت پا با وزن مولکولی زیرواحد به خوبی کم شده باید برای ساخت چنین موردی استفاده شود. منحنی استاندارد جداول وزنهای مولکولی پروتئینها و زیرواحدهای پروتئینی را که توسط D arnall و Klotz (1972) گردآوری شدهاند، میتوان برای تعیین آسان وزن مولکولی پروتئینهای استاندارد مورد استفاده با محاسبه مساحت زیر ردیابی تراکمسنجی باند پروتئین دادهشده و رسم این مقدار در برابر p. بارگذاری شده (این کار معمولاً با الکتروفورز و اسکن سری های مختلف انجام می شود، اما شناخته شده، مقادیر پروتئین بسیار خالص شده (نگاه کنید به شکل 6)، یک منحنی استاندارد را می توان همانطور که در سمت راست پایین شکل 5 نشان داده شده است، ساخت.
به دنبال این، یک مخلوط نمونه حاوی مقدار نامعلومی از آن جزء را می توان الکتروفورز و اسکن کرد. منحنی استاندارد vsmobility در سمت راست بالای شکل 5، و مقدار آن جزء پروتئین موجود در نمونه اصلی را می توان از یک منحنی استاندارد مانند آنچه در سمت راست پایین شکل 5 نشان داده شده است، تعیین کرد.
با بار تک تک پروتئین ها باید کمیت سنجی در نظر گرفته شود تعدادی از تکنیک های رنگ آمیزی پروتئین شناسایی یون در حال حاضر به طور گسترده در مطالعات کمی استفاده می شود (Watkh and M iller, 1970; فیشبین، 1972; داتینر و فینیمور، 1973; راکوسن، 1973; P otter، 1974) استفاده گسترده و تطبیق پذیری SDS-PAGE در درجه اول به دلیل قابلیت SDS، یک شوینده آنیونی، حل شدن طیف وسیعی از اندام های سلولی به طور معمول نامحلول، مانند غشاء و فیبریل ها، و همچنین حل شدن حل نشدن پروانه ها و اجزای MacLen است.
به طور موثری از SDS-PAGE در کار ظریف خود بر روی ترکیب پروتئین شبکه سارکوپلاسمی و مطالعاتی بر روی خواص پروتئین های شبکه ای سارکوپلاسمی خالص شده استفاده کرده اند (Macknnan, 1974; Ostwald and MElcLennan, 1974; Stewart and Macnnan) شبکه بدون ساکن قبلی SDS-PAGE بسیار کندتر بود
210 PROTEN LCAUE3 r!3 ‘? 06-1d 74 4c ow – شکل 6 الکتروفورز SDS-پلی آکریل آمید اسکلت خوک – اکتینین A llgelsare 7 پلی آکریل آمید 1$2$ ژل ها با مقادیر متفاوت، اما شناخته شده ای از a – اکتینین که در یک عمل جراحی مشخص شده است، بارگیری شده اند.
هر ژل این اطلاعات سپس برای ساخت منحنی استاندارد برای اندازهگیری استفاده میشود همانطور که به صورت شماتیک در شکل 5، پایین سمت راست نشان داده شده است.
13 211 SDS-PAGE به طور فزاینده ای برای مطالعه پروتئین های میوفیبریلار عضله استفاده می شود Sender (1971) و Scopes و Penny (1971) از اولین محققینی بودند که میوفیبریل های دست نخورده جدا شده را در SDS حل کردند، نمونه ها را به SDS-PAGE و shm قرار دادند.
که پروتئینهای میوفیبریلار اصلی را میتوان به راحتی با توجه به تحرک آنها شناسایی کرد و بنابراین، وزن مولکولی آنها پاتر (1974) اخیراً از SDS-PAGE استفاده کرده است و به دنبال آن کمی سازی دقیق انجام شده است
تا نشان دهد که نسبتهای مولی تقریبی پروتئینهای میوفیبریلار اصلی در خرگوش عضله اسکلتی عبارتند از: اکتین: میوزین: تروپوکیتوزین: تروپونین T: تروپونین: تروپونین C = 7:l:l:l:l: واضح است که SDS-PAGE یک ابزار قدرتمند برای مطالعات زیست شناسی عضلانی و علم گوشت است. در سایر زمینههای بیولوژیکی است. مثالهای زیر از آزمایشگاه خود ما انتخاب شدهاند تا به طور خلاصه برخی از کاربردهای PAGE در بیولوژی ماهیچهها و تحقیقات علم گوشت را نشان دهند. ارتباط وی برای ارائه یک بحث کامل در مورد هر مشکل تحقیقاتی ذکر شده در عوض، هدف در هر نمونه صرفاً توصیف نوع اطلاعاتی خواهد بود که میتوان با PAGE مقایسه a-اکتینینها از ماهیچههای متفاوت در ترکیب نوع فیبر t به خوبی به دست آورد.
ثابت کرد که تغییر ساختاری عمده مشاهده شده در طول ذخیره سازی پس از مرگ عضله، از هم پاشیدگی تدریجی خط Z است (Goll et al, 1971; 1974) اگرچه ترکیب کامل ساختار Z-line ناشناخته است، ما نشان دادیم که حداقل تا حدی از پروتئین a-actinin تشکیل شده است (Goll– et al, 1969; Robson – et, * a1, 1970؛ Schollmeyer et al, 1973; Stromer — et a1, 1969) t همچنین گزارش شده است که عرض خط Z می تواند به عنوان یکی از معیارها برای تمایز بین انواع الیاف استفاده شود (Gauthier, 1969) خطوط Z الیاف قرمز.
در ماهیچه های اسکلتی پستانداران تقریباً دو برابر الیاف سفید پهن است، با خطوط Z الیاف میانی دارای عرض بین الیاف قرمز و سفید است (Gauthier, 1970; Suzuki et al, 1973) تفاوت هایی در Z- وجود دارد.
ساختار خط (و از این رو، برخی از تفاوتها در رفتار پس از مرگ در میان ماهیچههایی که در ترکیب نوع فیبر متفاوت هستند) ممکن است تا حدی به دلیل ویژگیهای مشخصه a-اکتینین موجود باشد. قسمت های تیره عضله نیمه تاندینوز خوک (رابسون و زیس، 1973; سوزوکی و همکاران، 1973) PAGE انجام شده هم در حضور و هم در غیاب SDS برای مشخص کردن تفاوتها و شباهتها بین این a-اکتینینهای قلبی، قرمز و سفید بسیار مفید بود. اکتینین تهیه شده از سه منبع مختلف ماهیچه ای در این مطالعات مشهود بود که a-اکتینین قلبی به صورت یک نوار (همگن) ظاهر می شود، در حالی که بیشتر اسکلتی سبک
14 212 lop Ot ael slab J erface CDL شکل 7 ژل الکتروفورز پلی آکریل آمید (بدون SDS) a-اکتینین پس از خالص سازی توسط دو ستون DEAE-سلولزی غلظت آکریل آمید 4% لایه لایه بیش از 6 دلار بود که سطح رابط در هر چاه پروتئین اعمال شده در شکل نشان داده شده است. thegelslab 30 pg بود نمونهها C (قلبی)، D (اسکلت تیره) و L (اسکلت نوری) a – اکتینینها بودند که از شکل 3 در Robson و Zeece (1973) با اجازه E lsevier S cientific Publishing Co، آمستردام مراجعه کنید به منبع برای افزودن. شرایط تجربی
اکتینین به عنوان باند مشخص با تحرک آهسته تر از قلب مهاجرت کرد.
باند منطبق با قلب a – اکتینین کندترین نوار از سه نوار در اسکلت تاریک – اکتینین دقیقاً با نوار اصلی از اسکلت نور منطبق بود – اکتینین همانطور که انتظار می رفت زیرا نمونه عضله اصلی حاوی مقداری فیبر سفید بود. نوار میانی ممکن است نشان دهنده یک نوع مولکوله اکتین باشد. یک الکتروفورتوگرام از سه اکتینین خوک a – نشان داده شده در شکل 8 نشان می دهد که تمام سه – اکتینین به عنوان یک باند در SDS-PAGE مهاجرت می کنند، هیچ تفاوت قابل توجهی در مهاجرت گناه وجود ندارد،
و بنابراین، اندازه زیر واحدهای تآ – اکتینین در بین سه نمونه خوک هنگام اجرا در حفره های آزمایشگاهی آزمایشگاهی مجاور مشاهده شد. وزنهای مولکولی زیر واحدها با نشانگرهای مناسب تعیین میشوند و مقدار تقریباً 95000 برای همه سه اکتینین به دست میآیند (شکل 9). بنابراین، در حالی که نتایج PAGE در غیاب SDS (که توسط سایر مطالعات بیوشیمیایی اثبات شده است) انجام شد، تفاوت معنی داری را در بین تآکتینین ها نشان داد، نتایج SDS-PAGE نشان داد که این آکتینین ها تفاوتی بین مولکول های اولیه ندارند. توانستند نتیجه بگیرند که a – اکتینین قلبی و بخش عمده a – اکتینین از عضله اسکلتی تیره مشابه هستند، اگر نگوییم یکسان، اما هر دو به طور قابل توجهی در خواص مولکولی خاص از سهم عمده a – اکتینین جدا شده از عضله اسکلتی سبک برای تعیین اینکه آیا این تفاوت ها متفاوت است، جالب خواهد بود.
اکتینین مسئولیت پذیر است معماری خط Z انواع مختلفی از الیاف را نشان می دهد و اینکه آیا آنها ممکن است پاسخگوی تغییرات پس از مرگ در یکپارچگی میوفیبریل باشند (Dutson et al, 1974) و inthemyofibrillarprot eins (Hay et,* a1 1973) که از ماهیچه های -typefiber جدا شده اند.
تصفیه فاکتور فعال شده Caz+ (CAF3) مسئول از دست دادن خطوط Z پس از مرگ مطالعات اخیر در OUT — آزمایشگاه (Busch et al, 1972a; 1972b; Go11 و 1971; 1974) می گویند که تغییرات ساختاری پس از مرگ در میوفیبریل های عضلانی اسکلتی که با وضوح سختی همراه است ممکن است ناشی از یک پروتئاز فعال شده با Caz + سیتوپلاسم سلول عضلانی موجود باشد
این آنزیم توانایی قابل توجهی در حذف خطوط Z دارد و همچنین ممکن است باعث از هم گسیختگی محدود M-line شود. و طولانی شدن سارکومرهای با سختی کوتاه شده توسط برش های پروتئولیتیک محدود (Go11 و همکاران، 1974؛ استرومر و همکاران، 195) این آنزیم اکنون به طور موفقیت آمیزی خالص شده است، و اثرات آن بر تخریب پروتئین های فیبریلی آنها در 49 روز گذشته مورد بررسی قرار گرفته است. *,a ؛ Dayton et a1 منتشر نشده)
L c شکل 8 ژل الکتروفورز SDS-پلی آکریل آمید
اکتین پس از خالص سازی توسط دو ستون DE و سلولزی دال پلی آکریل آمید حاوی 5% آکریل آمید و نسبت 40:l (وزنی/وزنی) آکریل آمید-آکریل آمید تاکرواکرومید است. از پروتئین استفاده شده در هر چاه نمونه ها C (قلبی)، D (اسکلتی تاریک) و L (اسکلتی نور) a-اکتینین بودند که از شکل 5 در Robson and Zeece (1973) با مجوز E lsevier S cientific Publishing Co, Amsterdam See. مرجع شرایط آزمایشی اضافی
17 فسفر y به عنوان فسفات دهیدروژناز کیموتریپسینوژن A 1 0 i Mobi i ty (mm) شکل 9 تعیین وزن مولکولی زنجیره پلی پپتیدی a-اکتینین اسکلتی سبک با مقایسه تحرک آن با پروتئین های نشانگر موجود در شکاف های چاهک ad3acent در SDS الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بازتولید شده از شکل 6 در رابسون و ریس (1973) با کسب اجازه از شرکت انتشاراتی Elsevier Scientif ic، آمستردام
216 سنجش استفاده شده برای مونتور CAF PURFCATON TABLE V
تعیین 1 Z – D است k-حذف A ctivity 2 میزان حذف دیسک Z از میوفیبریل ها با بررسی در میکروسکوپ فاز – قابلیت حل شدن میوفیبریل P rotein 3 A bilyto Hydrolyze – تعیین میزان رهاسازی مواد پپتیدی محلول در 100 میلی متر KC 1 frm myofibrils تعیین سرعت آزادسازی مواد محلول TCA از ژل پلی آکریل آمید کازئین الکتروفورز در S odim Dodecyl S sulfate 5 ژل پلی آکریل آمید الکتروفورز در Tris ediethy ~ ~ ~ PH ~ ~ ~ ~ ~ PH biturate TABU3 VS ~~~~ ~ CHROMATOGRAPHC PURFCATON OF CAF 1 6% ستون آگارز – CAF Elutes 2 DEAE-Cellulose Column – CAF Elutes 3 Sephadex G-200 Column – CAF Elutes – Dete 3-4 برابر شدن فعالیت به میزان 3 برابر افزایش می یابد و 300 میلی متر KC
افزایش 1-10 برابری غیر اختصاصی بودن در سنجش کازئین – آخرین افزایش 3-4 برابری در ویژگی در روش سنجش کازئین. 235 و 260 میلیمتر KC 1 – L5-2 برابر عدم اختصاصیت در سنجش کازئین را افزایش میدهد جدول V سنجشهایی را فهرست میکند که برای نظارت بر خالصسازی CAF PAGE در حضور (شماره 4 در جدول V1) و عدم حضور (شماره 5 در جدول V) استفاده شدهاند. SDS دو مورد از پنج معیار مورد استفاده را تشکیل می دهد. خلاصه ای از چهار مرحله تصفیه کروماتوگرافی که به عنوان بخشی از خالص سازی CAF استفاده شده است در جدول V، نتایج SDS-PAGE آمده است.
الکتروفورز ژل 10 SDS-پلی آکریل آمید
19 قطعه فعال به دست آمده در طی خالص سازی کروماتوگرافیک خام Po-40 CAF A llgelsare 7% آکریل آمید G el Po-40 با 30 pg پروتئین بارگذاری شد. همه ژل های باقی مانده با 22 pg پروتئین بارگیری شدند. 11 ژل SDS-پلی آکریل آمید الکتروفورز میوزین عضله اسکلتی خوک حاوی C-pro قبل و بعد از درمان با CAF نمونه های G elsa و cscontrol که در آن EDTA به منظور اتصال هر اثری از Ca2′ برای جلوگیری از CAF ژل های b و d به میوزین و C- اضافه شد. پروتئین پس از 60 انکوباسیون با CAF در دمای 25 درجه سانتی گراد در محیطی که در میلی متر CaCl2 هر دو ژل آکریل آمید 7% و l@ نشان دهنده HC = زنجیره سنگین یا زیر واحدهای myos DTNB و A-2 = زیر واحدهای سبک میوزین هستند – _ (Weeds- an- 3-
ab C تعریف 12 ژل الکتروفورز SDS-پلی آکریل آمید
شکل 13 SDS-پلی آکریل آمید ژل الکتروفورزی ژل الکتروفورزی عضله اسکلتی خوک تروپونین و تروپومیوزین عضله اسکلتی رسین فردی قبل و بعد از زیرواحدهای تروپونین A llgelsare 7% آکریللامید آکریللامید و آکریل آمید F6 هستند. th TN = ژل تروپونین اصلی T، نمونه کنترلی است که در آن EDTA اضافه شده است. تنها 7 pg تروپومیوزین توسط کرونوتوگرافی DEAE-سلولز در دستگاه حاضر به منظور حل دو زیرواحد 6 مولار ژل اوره TN با 20 pg تروپونین رسین اسکلتی تروپومیوزین ژل های c و d بارگذاری شد، نشان می دهد tropog els با T 7s بارگذاری شده است. تروپونینوزین پس از 60 دقیقه جوجه کشی که CAF در دمای 25 درجه سانتیگراد و تروپونین-، به ترتیب. ژل C- با مدیوم شامل 5 میلی متر CaC12 و CAF به تروپومیوزین 15 pg تروپونین-c تیوس 1:200 وزنی بارگذاری شد. ژل با 25 انجیر اوتین و ژل و با 7 pg پروتئین بارگذاری شد. ژل حاوی 25 pg تروپومیوزین و ژل بارگیری شده با pg tropomyosin 7
21 ab C d DAYS POST-MORTEM t 230,000- locj,000- TN-T-mni ,00034,000- TN – TN – C- re 14 الکتروفورز ژل SDS-پلی آکریل آمید از رسین عضله اسکلتی تروپونینل و بعد از درمان A 16 پلی آکریل آمید goy-5 pg پروتئین بر روی هر ژل ال ای لود شد و 2 نمونه شاهد نشان داده شد که در آن EDTA قبل از CAF حذف شد G elb تروپونین را پس از 60 E در دمای 25 درجه سانتیگراد در محیط انکوباسیون با C حاوی 5 میلی متر CaC٪ نشان می دهد. نسبت CAF به تروپونین 200 وزنی ژل d نشان می دهد که تروپونین به عنوان ژل درمان شده و نسبت تروپونین بوتاتا CAF t E با وزن 1:2000 شکل 15 میوفیبریل های الکتروفورز ژل SDS-پلی آکریل آمید تهیه شده از عضله اسکلتی گاو 6 آکریل آمید. postmortem atk CA llgelsare 1 pg پروتئین روی هر ژل F Olson، DG و FCP arrish بارگذاری شده است، منتشر نشده
آزمایش انجام شده بر روی نمونه بارگذاری شده
( P0,4o =کسر رسوبی سولفات آمونیون از عصاره سارکوپلاسمی محلول بین ph 49 و 62) روی ستون اول همراه با فعال ترین پروتئین شسته شده از هر ستون بعدی در شکل 10 نشان داده شده است. Po-40 اولیه نشان داده شده است. نمونه بسیار ناهمگن است، اما بعد از ستون چهارم، پروتئین در ژل های SDS به عنوان سه جزء از وزن های مولکولی 80000، 60000 و 30000 دالتون مهاجرت می کند.
خالص سازی کروماتوگرافی اضافی تراکم سنجی ژل SDS-پلی آکریل آمید نشان می دهد که 80000 و 30000 کمپوننت زیر وزن مولکولی در نسبت های مولی مساوی وجود دارند. مولکول CRF دالتون – از آنجایی که CAF اولین آنزیم پروتئولیتیک است درون زا برای ماهیچه ای که توانایی هضم اکتمیوفیبریل ها را دارد (Busch etal, 1972a)، مطالعاتی در مورد توانایی CAF در تخریب پروتئین های فیبریل آنها میوزین، پروتئین C، a – اکتینین، اکتین، تروپومیوزین و تروپونین انجام شد.
با انکوبه کردن CAF با آرپروتئین میوفیبریل خالص شده به مدت 60 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد در حضور 5 میلی متر Ca2. عمل CAF با افزودن EDTA به غلظت نهایی 10 میلی متر EDTA متوقف شد. بر روی جرم زنجیره های سنگین یا سبک میوزین (شکل 11) این تعجب آور است زیرا میوزین به سرعت توسط طیف گسترده ای از آنزیم های پروتئولیتیک تجزیه می شود.
تجزیه شده توسط زنجیره پپتیدی CAF toa با جرم کمی کمتر از زنجیره پپتیدی CAF بومی C-proteTn، آجیل را خالصسازی میکند. ra – اکتینین این یافته غیرمنتظره است زیرا a – اکتینین در خط 2 – است ، a – اکتینین به اکتینین ویترو متصل می شود (Go11 et al, 1972; Robsm etal، 1970) و CAF خطوط Z را تجزیه می کنند – اگرچه CAF میوزین، اکتین، اورا-اکتینین را تجزیه نمی کند، تروپومیوزین را تجزیه می کند (شکل 12) و تروپونین (شکل 14) CAF تروپومیوزین را به گروهی از قطعات با مولکولی تجزیه می کند.
وزنهایی در محدوده 13000 تا l8، ooo دالتون، مجموعهای از قطعات حتی کوچکتر (شکل 12، ژل و د) شکل 13 (ژل TN) نمونهای از تروپونین اسکلتی خوک خالص شده را نشان میدهد که برای مطالعه هضم توسط CAF ژلهای T و C infigure 13 استفاده میشود.
نمونه هایی از زیر واحدهای تروپونین منفرد (گریزر و گرگلی، 1973) که با کروماتوگرافی سلولز DW در حضور 6 مولار اوره جدا کرده ایم. با وزن 1:2000 نشان می دهد که تروپونین-t قبل از تروپونین تجزیه می شود (شکل 14، ژل و د) واضح است که SDS-PAGE تکنیک بسیار مفیدی در مطالعه تصفیه CAF و سنجش توانایی آن برای تخریب خاص عاقلانه بوده است. آرپروتئین های میوفیبریل خالص شده
اثر ذخیرهسازی پس از مرگ بر روی پروتئینهای M yofibrillar که SDS-PAGE را میتوان برای مطالعه فیبرهای واقعی استفاده کرد، آن را به روشی بسیار حساس و راحت برای تشخیص ائولیز پروت پس از مرگ تبدیل میکند.
دوره های زمانی پس از مرگ (Olson، DG و FCP می رسند، منتشر نشده) اگرچه این مطالعات هنوز تکمیل نشده است، نتایج در شکل 15 نشان دهنده مقداری از دست دادن تروپونین-t (باند M بالای دوبل tropomycxiri در 34000 دالتون) در طول ذخیره سازی پس از مرگ A است.
وزن مولکولی تقریباً 30000 دالتون در نمونههای عضله پیر دیده میشود که تغییرات مشابهی را میتوان با درمان میوفیبریلهای صفر روزه با CAF به دست آورد، این پیشنهاد را تأیید میکند که CAF مسئول بسیاری از تخریب پس از مرگ است. ) C ONC U SONS اگرچه این بررسی به بحث در مورد استفاده از PAGE محدود شده است (با و بدون SDS) با مطالعه 33 پروتئین، سودمندی مطالعات PAGE در تحقیقات زیست شناسی عضلانی و علم گوشت باید مشهود باشد SDS-PAGE، inpwticulnr، یک تکنیک قدرتمند است که قابلیت کاربرد گسترده ای برای مشکلات در هر دو حوزه اساسی و کاربردی دارد، امیدواریم که این ارتباط باعث افزایش استفاده از PAGE شود. توسط کسانی که هنوز با این تکنیک آشنا نیستند،
ما از جوآن اندرسن و باربارا هاومان برای کمک به این دستنویس کمک میکنیم تا دکتر فرد سیپی آریش و دانشآموزانش، دنیس جی اولسون و سیاس چنگ، اجازه نمایش برخی از کارهایشان را در جلسه RMC بدهند. ما همچنین از مری برمر، جی آکی هاروی و دارلین مارکلی برای کمک فنی متخصص تشکر می کنیم
24 222 LTERATURE CTED Busch, WA, DE Go11 and FCP arrish, Jr 1972a خواص مولکولی رشد کشش ماهیچه پس از مرگ و کاهش ماهیچه گاو، خوک و خرگوش J Food S ci 37:289 Busch, WA, MH Stromer, DE Go11 سوزوکی 1972b Ca2
حذف اختصاصی خطوط Z از عضله اسکلت خرگوش JC ell B iol 52:367 Chrambach, A and D Science 172:440 Rodbard 1971 ژل الکتروفورزیس پلی آکریل آمید Darnall, DW and M Klotz rodnichreed 19 Biochem Biophys 149:1 Datyner, A and ED Finnimore 1973 روشی پیش رنگ آمیزی برای سنجش کمی پروتئین ها بر روی ژل های پلی آکریل آمید Anal Biochem 55:479 دیویس، BJ 1964
الکتروفورز دیسک 11 روش و کاربرد برای پروتئین های سرم 1
و NY2، S41 WR، DEG oll، WJR eville، MG Zeece، MH Stromer و RM Robson 1974 P urification و برخی از خواص آنزیم ماهیچه ای که میوفیبریل ها را تخریب می کند Fed Proc 33:1580 Dayton، WR، DEG oll، MH Stromer، WJ Reville، MG Zeee آر ام رابسون 19 75 برخی از خواص یک پروتئاز فعال شده با Caz+ که ممکن است در گردش پروتئین میوفیبریل دخیل باشد. :5074 Dutson, TR, AM Pearson, RA Merkel and GC Spink 1974 U تغییرات ساختاری پس از مرگ در فیبرهای عضلانی خوک طبیعی و با کیفیت پایین J Food S ci 39:32 Fishbein, WN 1972 چگالی سنجی کمی از 1-50 ژل پروتئینی 1 تا 50 پروتئین آبی لام سی کیو. Anal Biochem 46:388 F lorini، JR و RPB rivio 1969 الکتروفورز دیسکی از میوزین و مشتقات میوزین، ژل های پلی آکریل آمید رقیق شده Anal Biochem 30:358 F lorini، JR، RP Brivio و BA MB attelle 1973 پروتئین های دیگر NY Acad S ci 2O9:299
25 Gauthier, GF 1969 در مورد رابطه 3f ویژگی های فراساختاری و سیتوشیمیایی با رنگ در ماهیچه اسکلتی پستانداران ZZ, ellforsch 95:462 Gauthier, GF 1970 فراساختار سه نوع فیبر در ماهیچه اسکلتی مادران N: Physiology of Muscle11 aist (Briskey, EJ, RG Cassens, and BB Marsh, ei University of Wisconsin Press, Madison Goll, DE, WFHM Mommaerts, MK Reedy and K Seraydarian 1969 مطالعات بر روی پروتئین های شبه آکتینین آزاد شده در طی هضم تریپسین a-اکتینین و myofibrils Biochim Biophys Acta 175:174 Goll, DE, MH Stromer, DG Olson, WR Dayton, A Suzuki and RM Robson 1974 نقش پروتئین های میوفیبریلار در نرمی گوشت Proc Meat nd Res Conf (n press) Goll, DE, MH Stro RM Robson، J Temple، BA Eason و WA Busch 1971 هضم تریپتیک اجزای عضلانی بسیاری از تغییرات ناشی از ذخیره سازی پس از مرگ J him Sci 33: 963 Goll، DE، A Suzuki، J Temple و GR
Holmes 1972 مطالعات در مورد a- خالص شده را متوقف می کند. اکتینین اثر دما d tropomyosin در برهمکنش a-اکتینین/f-اکتین J Mol Biol 67:469 Gordon, AH 1969 الکتروفورز پروتئین ها در ژل های پلی آکریل آمید و نشاسته N: تکنیک های آزمایشگاهی در بیوشیمی و بیولو مولکولی (Work, TS and E), pp American Elsevier Publishing Co, nc, New York Greaser, ML and J Gergely 1973 خالص سازی و خواص اجزای tropmin J Biol Chem 248:2l25 Hay, JD, RW Currie and FH Wolfe 1973 دیسک پلی آکریل آمید و الکتروفورز ژل تازه جوجه پروتئینهای m kle در سدیم دودسیل سولفات J Food Sei 38:937 Laemmli، UK 1970 برش پروتئینهای ساختاری در طول مونتاژ سر باکتریوفاژ T4 Nature 227:68O MacLennan, DH 1974 solation of a second form of Ccalehem 249: الکتروفورز دیسکی و تکنیکهای مرتبط ماورر، الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید HR Walter de Gruyter, New York Neville, DM, Jr 1971 تعیین وزن مولکولی کمپلکسهای پروتئیندودسیل سولفات با الکتروفورز ژل در یک ناقص سیستم بافر uous J Biol Chem 246:6328 Ornstein, L 1964 دیسک الکتروفورز پیشینه و نظریه Ann NY Acad Sci Ul:32l
224 Ostwald، TJ و DH Macknnan 1974 solatimofa پروتئین متصل شونده به کلسیم با میل ترکیبی بالا از شبکه سارکوپلاسمی JB id Chem 249: 974 Peterson، RF 1971 آزمایش برای خلوص پروتئین ها توسط ژل الکتروفورز 197D، محتوای ژل الکتروفورز 19D19D.
، اکتین و میوزین میوفیبریل های عضله اسکلتی خرگوش Arch Biochem Biophys 162 :436 Racusen, D 1973 استوکیومتری واکنش آمیدو سیاه با پروتئین Anal Biochem 52:96 Raymond, S و L Weintraub 1959 Reymond, S and L Weintraub 1959 Reymond, S and L Weintraub, 1959 Reymond, S and L. JA and C Tanford 1970 ترکیب ناخالص مجتمعهای pmtein-sodium dodecyl sulfate JB iol Shem 245:5161 R ighetti، PG و JW Drysdale 1973 تقسیمبندی در مقیاس کوچک پروتئینها و اسیدهای نوکلئیکآمید توسط ژلسازی ایزوالکتری 20. 163 Robson، RM، DEG oll، N Arakawa و MH Stromer 1970 P تصفیه و خواص یک – اکتینین از عضله اسکلتی خرگوش Biochim Biophys Acta 200: 296 R obson, RM و MG Zeece 1973 مطالعات تطبیقی a – اکتینین از ماهیچه های قلبی و اسکلتی خوک Biochim Biophys Acta 295 :209 Schollmeyer, JE, DE Goll, RM Robson and MH Stromer 1973 محلی سازی a – اکتینین عضلانی و عضله های اسکلتی iol 59:306a Scopes, RK and F Penny 1971 اندازههای زیرواحد پروتئینهای عضلانی تعیینشده توسط سدیم دودسیل سولفاتژل الکتروفور esis Biochim Biophys Acta 236:409 Sender, PM FEBS L ett 1971, Fibrils عضلانی : ژل ژل, ژل 17, 17, 17, 1971, ژل, ژل و فیبریلهای عضلانی. Vinuela and JV Maizel 1967 تخمین وزن مولکولی زنجیره های پلی پپتیدی توسط ژل های الکتروفورزیسین SDS-پلی آکریل آمید Biochem Biophys Res Commun 28:815 S tarr, R and GO ffer 1971 زنجیره های پلی پپتیدی با وزن مولکولی متوسط آماده سازی FEBS0 در my FE15: و DH Macnnan 1974 ذره های سطحی غشاهای شبکه سارکوپلاسمی ویژگی های ساختاری آدنوزین تری فسفاتاز JB id Chem 249 ~ 9 8 5