الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید پروتئین های خون

الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) پروتئین های خون جان سی. مورداک و روبرتا دبلیو. الینگتون گروه علوم زیستی دانشگاه نورث وسترن اوانستون، ایلینوی جان لیسانس خود را در سال 1984 از دانشگاه ایلینویز دریافت کرد و دکترای خود را دریافت کرد. در سال 1991 از دانشگاه نورث وسترن. از سال 1992، او مدرس و مدیر آزمایشگاه های کارشناسی در شمال غربی در گروه علوم زیستی بوده است. روبرتا مدرک لیسانس خود را در زیست شناسی از کالج بارات، لیک فارست، ایلینویز و کارشناسی ارشد خود را از دانشگاه لویولا، شیکاگو دریافت کرد. از سال 1986، او مدرس/آمادگی در نورث وسترن در برنامه کارشناسی علوم زیستی بوده است. تجدید چاپ شده از: Mordacq، JC و RW Ellington Ellington ژل الکتروفورز پلی آکریل آمید (PAGE) پروتئین های خون. صفحات 15-44، در مطالعات آزمایش شده برای تدریس آزمایشگاهی، جلد 15 (CA Goldman، ویرایشگر).

مجموعه مقالات پانزدهمین کارگاه/کنفرانس انجمن آموزش آزمایشگاهی زیست شناسی (ABLE)، 390 صفحه. – خط‌مشی حق چاپ: اگرچه تمرین‌های آزمایشگاهی در مجلدات ABLE آزمایش شده‌اند و توجه لازم به ایمنی داده شده است، افرادی که این تمرین‌ها را انجام می‌دهند باید تمام مسئولیت ریسک را بر عهده بگیرند. انجمن آموزش آزمایشگاهی زیست شناسی (ABLE) هر گونه مسئولیتی در رابطه با ایمنی در رابطه با استفاده از تمرینات در مجلدات خود جان سی. مرداک و روبرتا دبلیو الینگتون انجمن آموزش آزمایشگاهی زیست شناسی (ABLE) ~ 15 رد می کند.

محتویات الکتروفورز پلی آکریل آمید مقدمه

16 طرح کلی دانش آموز…17 مقدمه…17 هدف…18 اطلاعات پیش زمینه…18 رویه های آزمایشگاهی رویه های روز آزمایشگاه گزارش آزمایشگاه روز…32 داده…33 رویه نمودار جریان… 34 قدردانی… 35 ادبیات نقل شده… 35 ضمیمه الف: نتیجه تجربی… 36 ضمیمه ب: راهنمای آماده ساز… 37 پیوست ج: منبع مواد… 43 مقدمه این تمرین آزمایشگاهی است در Northwestern برای توالی زیست شناسی مقدماتی در طول سه ماهه که موضوعات زیست شناسی سلولی و فیزیولوژی را پوشش می دهد، استفاده می شود. در این تمرین، دانش‌آموزان یاد می‌گیرند که چگونه از چندین تکنیک رایج در بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی استفاده کنند.

این تکنیک ها شامل، رسوب دیفرانسیل، سانتریفیوژ، و استخراج مواد شوینده است. اکثر دانش‌آموزان این دوره را در سال دوم تحصیلی می‌گذرانند و اکثر آنها یا رشته‌های زیست‌شناسی هستند یا دانش‌آموزانی که برنامه درسی پیش‌پزشکی را می‌گذرانند. دانش آموزان در گروه های 24 نفره آموزش داده می شوند و به صورت دو نفره کار می کنند. هر جفت دانش آموز یک ژل را با یک جفت دیگر به اشتراک می گذارند. این یک آرایش راحت است که تنها به شش دستگاه ژل در هر اتاق نیاز دارد.

این آزمایشگاه به آمادگی و سازماندهی زیادی نیاز دارد.

اگرچه این آزمایشگاه در کمتر از 3 ساعت توسط دانش‌آموزان انجام می‌شود، اما لازم است کارکنان آمادگی روز بعد را صرف رنگ‌آمیزی و رنگ‌زدایی ژل‌ها کنند تا دانش‌آموزان بتوانند در روز سوم وارد شوند و نتایج خود را بررسی کنند. فهرست مفصلی از مواد و پروتکل ها را می توان در پیوست ها یافت. بسته به سطح دانش آموزان، این تمرین ممکن است نیاز به اصلاح داشته باشد. به عنوان مثال، بحث کمی در مورد پیوندهای دی سولفید و نقش آنها در ساختار پروتئین وجود دارد.

بافر نمونه مورد استفاده در این تمرین حاوی یک عامل کاهنده است که محیطی از تیول های اضافی ایجاد می کند که تمام پیوندهای دی سولفید موجود در پروتئین ها را کاهش می دهد. بنابراین، پروتئین به زیر واحدهای پروتئینی منفرد دناتوره می شود. ژل های پلی آکریل آمید مورد استفاده در این تمرین با ژل های مورد استفاده در آزمایشگاه های تحقیقاتی تفاوت دارند زیرا ژل انباشته ای وجود ندارد که گاهی اوقات به عنوان یک سیستم بافر ناپیوسته شناخته می شود. ژل انباشته یک ژل جداگانه است که روی ژل در حال اجرا ریخته می شود و دارای درصد آکریل آمید کمتر و بافر ph متفاوت است.

به دلیل این شرایط، پروتئین ها در نهایت در نوارهای باریک متمرکز در پایین ژل انباشته می شوند.

ژل های انباشته وضوح بهتری دارند، اما زمان آماده سازی بیشتری را شامل می شوند و نیاز دارند که ژل ها به صورت عمودی ریخته شوند. ژل هایی که استفاده می کنیم به صورت افقی ریخته می شوند که باعث صرفه جویی در زمان بیشتر می شود و کمتر مستعد نشتی است. بحث در مورد انباشتن ژل ها و روش های انجام الکتروفورز پلی آکریل آمید را می توان در دو کتابچه راهنمای آزمایشگاهی مختلف یافت: Sambrook et al. (1989) و Ausubel et al. (1990).

الکتروفورز پلی آکریل آمید طرح کلی دانش آموز مقدمه انواع مختلف کروماتوگرافی بیانگر تکنیک های قدرتمند و پرکاربرد برای جداسازی مخلوط مولکول های بیولوژیکی به اجزای جداگانه آنهاست. اما همانطور که ممکن است تصور کنید، آن بیوشیمی‌دانان باهوش و پرتلاش در طول قرن گذشته روش‌های زیادی را برای جداسازی مولکول‌ها از مخلوط‌ها نیز توسعه داده‌اند.

مهمترین آنها روشهای الکتروفورز مختلف است که الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز آگارز از انواع اصلی آن هستند. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید، با تمام تغییرات مختلف آن احتمالاً پرکاربردترین روش در بیوشیمی معاصر و زیست شناسی مولکولی است. تمام روش های الکتروفورتیک بر این واقعیت استوار است که مولکول های باردار در محلول آبی در یک میدان الکتریکی مهاجرت می کنند. همچنین انواع مختلفی از تکنیک‌های جداسازی دسته‌ای مانند بارش تفاضلی، دناتوراسیون دیفرانسیل، و استخراج تفاضلی مهم هستند که همگی بر اساس خواص حل‌پذیری گونه‌های مولکولی مورد نظر هستند.

اگرچه در حال حاضر به اندازه سابق به طور گسترده مورد استفاده قرار نمی گیرد

تکنیک های دسته ای هنوز برای بسیاری از کاربردها، به ویژه مواردی که در آن مقادیر زیادی از مواد در حال خالص سازی هستند، ضروری هستند. در این تمرین آزمایشگاهی، شما از رسوب دیفرانسیل و الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید در ترکیب با سانتریفیوژ و استخراج مواد شوینده برای تکه تکه کردن مخلوط پیچیده پروتئین های موجود در گلبول های قرمز پستانداران و پلاسمای خون پستانداران و مشخص کردن برخی از پروتئین های تشکیل دهنده استفاده خواهید کرد.

از بین کلاس‌های مختلف مولکول‌های آلی درون سلولی، این پروتئین‌ها هستند

که بدون شک از نظر اندازه، ساختار و عملکرد متغیرترین هستند. بنابراین، جداسازی و جداسازی پروتئین ها از منابع طبیعی به طور سنتی یکی از حوزه های اصلی تحقیقات در بیوشیمی بوده و امروزه نیز ادامه دارد. از آنجایی که پروتئین ها مولکول های فعال سلول هستند، این ماکرومولکول های بزرگ و پیچیده مورد توجه محققانی هستند که در بسیاری از زمینه های تحقیقات بیولوژیکی معاصر کار می کنند.

بسیاری از پروتئین‌ها تنها در محدوده نسبتاً محدودی از شرایط تجربی پایدار هستند.

اگر از حد تجاوز شود، دناتوره شدن در نتیجه تغییر درون مولکولی و/یا تکه تکه شدن با از دست دادن متعاقب فعالیت بیولوژیکی رخ می دهد. دو تکنیک شکنش که در این تمرین آزمایشگاهی بررسی خواهید کرد، به ویژه برای خالص‌سازی پروتئین‌ها مفید هستند، زیرا در شرایط با دقت کنترل شده، تخریب مولکول‌ها حداقل است. رسوب دیفرانسیل ممکن است به عنوان یک روش نیروی بی رحم برای تکه تکه کردن مخلوطی از پروتئین ها در نظر گرفته شود، زیرا معمولاً برای تقسیم مخلوط به تعداد کمی از بخش های مختلف، که هر کدام شامل گونه های مولکولی مختلفی است، استفاده می شود.

علاوه بر این، هر پروتئین خاص ممکن است در بیش از یک بخش وجود داشته باشد، به عنوان مثال، 80٪ ممکن است در به اصطلاح کسر اصلی با 10٪ هر کدام در دو بخش کوچک وجود داشته باشد. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بسیار پیچیده تر است زیرا می تواند پروتئین های منفرد را حتی آنهایی را که از نظر ساختاری کاملاً مشابه هستند از یکدیگر جدا کند. خون پستانداران به چند دلیل به عنوان منبع پروتئین برای جداسازی در این تمرین انتخاب شده است. این ماده ای است که هم شامل یک جزء مایع (پلاسما) و هم یک جزء سلولی است و این دو به راحتی با سانتریفیوژ از هم جدا می شوند.

پلاسما حاوی پروتئین های زیادی در محلول است.

سلول ها حاوی پروتئین های سیتوپلاسمی محلول داخل سلولی و همچنین پروتئین های غشایی (محیطی و انتگرال) هستند. بنابراین، خون پستانداران پروتئین های غشایی، پروتئین های سیتوپلاسمی و پروتئین های خارج سلولی را برای کار با آنها فراهم می کند. شما با جدا کردن سلول ها از پلاسما با سانتریفیوژ شروع می کنید.

سپس سلول ها برای حذف ردپای پروتئین های پلاسما شسته می شوند و متعاقباً در محیط هیپوتونیک لیز می شوند. غشای سلولی (ارواح) با سانتریفیوژ با سرعت بالا از پروتئین های سیتوپلاسمی جدا می شوند. در همین حال، مقدار کمی از پلاسما در معرض دو روش مختلف رسوب کسری قرار خواهد گرفت که سولفات آمونیوم و اتانول به عنوان عوامل رسوب‌دهنده استفاده می‌شوند. در نهایت، همه کسری خواهد شد

الکتروفورز پلی آکریل آمید با دی تیوتریتول (DTT)

یک معرف که پیوندهای دی سولفید را می شکند، درمان شود و در حضور ماده شوینده، سدیم دودسیل سولفات (SDS) تحت الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید قرار گیرد. اطلاعات پس زمینه در مورد جنبه های مختلف این تمرین آزمایشگاهی در زیر خلاصه شده است. اهداف هنگامی که این تمرین آزمایشگاهی را کامل کردید، باید بتوانید: 1. پروتئین های اصلی پلاسمای پستانداران را نام ببرید و به طور خلاصه شرح دهید.

پروتئین های اصلی مرتبط با غشای گلبول قرمز پستانداران را نام ببرید و به اختصار توضیح دهید.

3. منظور از بارش کسری، حلالیت، نمک زدایی و ثابت دی الکتریک را توضیح دهید. مکانیسم هایی را که توسط آن سولفات آمونیوم و اتانول باعث رسوب جزئی پروتئین ها می شوند را شرح دهد. 4. اصولی را که الکتروفورز بر آن استوار است توضیح دهید. بگویید معادله Ez = fv به چه معناست. توضیح دهید که μ چگونه تعریف می شود و چرا اهمیت دارد. توضیح دهید که چگالی بار به چه معناست.

بگویید SDS-PAGE چیست و چه تفاوتی با PAGE دارد. نقش پلی آکریل آمید و SDS در روش الکتروفورتیک را شرح دهد. 6. نحوه تهیه نمونه های پروتئینی برای SDS-PAGE و چرایی تهیه آنها به این روش را بگویید. نقش DTT را در بحث خود لحاظ کنید. 7. داده های SDS-PAGE را تفسیر کنید. پیشینه پروتئین های پلاسما پلاسمای پستانداران یک مجموعه سیال پیچیده است به این معنا که حاوی گونه های مولکولی مختلف است. این پیچیدگی از نقش بیولوژیکی آن به عنوان رسانه اصلی انتقال در بدن پستانداران ناشی می شود، زیرا همانطور که تصور می کنید، مواد مولکولی مختلفی وجود دارد که باید توزیع شوند.

مولکول های مواد مغذی از سیستم گوارشی گرفته می شوند، به سراسر بدن منتقل می شوند و به تمام سلول ها می رسند. مولکول‌های زائد از تمام سلول‌ها جمع‌آوری می‌شوند و به مکان‌های دفع مناسب تحویل می‌شوند: در درجه اول کلیه‌ها، ریه‌ها و پوست. مولکول های تنظیم کننده از سلول های غدد درون ریز مختلف برداشت می شوند و به بافت های هدف مختلف منتقل می شوند. آنزیم های پلاسما مشتق از بافت در مقادیر متغیر به خصوص در ارتباط با آسیب یا بیماری ظاهر می شوند.

سپس مولکول های دفاعی وجود دارد:

آنتی بادی ها در برابر موجودات مهاجم و همچنین گروهی از مولکول ها که توانایی ادغام و تشکیل لخته را دارند تا از خونریزی در هنگام شکستن رگ های خونی جلوگیری کنند. بسیاری از این مواد خود پروتئین هستند یا توسط پروتئین های حمل و نقل حمل می شوند.

تقریباً 100 پروتئین مختلف از پلاسمای انسان خالص شده و مشخص شده‌اند، اما پروتئین‌های جزئی زیادی باقی مانده‌اند که باید مشخص شوند. پروتئین های اصلی پلاسمای خون پستانداران را می توان به شرح زیر فهرست کرد: آلبومین، یک زنجیره پلی پپتیدی منفرد حاوی تقریباً 580 باقیمانده اسید آمینه، فراوان ترین پروتئین در پلاسمای پستانداران است (35 mg/ml 45). وزن مولکولی آن تقریباً 66 کیلو گرم است. (به یاد دارید که دالتون که برابر با جرم اتم هیدروژن است، واحد اصلی جرم مولکولی است و مخفف kd به معنای کیلودالتون است.

الکتروفورز پلی آکریل آمید 19 یا 1000 دالتون.

آلبومین که در سولفات آمونیوم نیمه اشباع محلول است، اسیدی ترین پروتئین اصلی پلاسما است. هنگامی که تکنیک های الکتروفورتیک برای اولین بار توسعه یافت، پلاسما یکی از اولین موادی بود که مورد مطالعه قرار گرفت. گلوبولین‌ها خانواده بزرگی از پروتئین‌های پلاسما هستند که در ابتدا بر اساس خواص حل‌پذیری آن‌ها تعریف شدند. گلوبولین ها شامل تمام پروتئین های پلاسما هستند که در سولفات آمونیوم نیمه اشباع نامحلول هستند.

گلوبولین های α با توجه به وزن مولکولی و عملکرد آنها بسیار متنوع هستند. پروترومبین (72 کیلو دالتون)، پروتئین اصلی سیستم انعقادی، یکی از گلوبولین های α است. بتا گلوبولین ها زیرگروه دوم گلوبولین ها را تشکیل می دهند. بتا گلوبولین ها نیز از نظر اندازه و عملکرد، گروه متنوعی از مولکول ها هستند. ترانسفرین ها، فراوان ترین بتا گلوبولین ها، دارای محدوده وزن مولکولی هستند که از kd متفاوت است. گلوبولین های γ که ایمونوگلوبولین ها نیز نامیده می شوند، شامل مولکول های آنتی بادی هستند.

سه کلاس اصلی (تعیین شده A، G و M) و دو کلاس فرعی (D و E) معمولاً وجود دارند.

ایمونوگلوبولین G (IgG) دومین پروتئین فراوان در پلاسمای انسان است (8 mg/ml 18). همه مولکول‌های گلوبولین γ از چهار زنجیره پلی پپتیدی تشکیل شده‌اند که توسط پیوندهای دی سولفیدی به هم متصل می‌شوند: دو زنجیره سنگین (4555kd) و دو زنجیره سبک (2535kd). آنها در ماهیت زنجیره هایی که درگیر هستند متفاوت هستند. وزن مولکولی آنها از kd متغیر است، به جز IgM، یک مولکول کل که در حدود 1000 کیلو دالتون بسیار بزرگتر است. فیبرینوژن فراوان ترین پروتئین انعقادی موجود در پلاسما (mg/ml) است.

وزن مولکولی آن 340 کیلو گرم است.

پروتئین های غشایی خون پستانداران حاوی چندین نوع سلول مختلف است. همه از زیست شناسی دبیرستان به اصطلاح سلول های قرمز (گلبول های قرمز) و گلبول های سفید (لکوسیت ها) را به یاد دارند. گلبول های قرمز تا حد زیادی فراوان ترین هستند (سلول در هر میلی لیتر خون در مردان انسان، سلول در هر میلی لیتر در زنان انسان).

لکوسیت ها، که انواع مختلفی از آنها وجود دارد، بسیار نادرتر هستند (سلول در هر میلی لیتر خون در انسان). گلبول های قرمز پستانداران به صورت سلول های نازک، گرد و دیسک مانند دوقعر وجود دارند که فاقد هسته و سایر اندامک های درون سلولی هستند. به دلیل این ساختار نسبتاً ساده و این واقعیت که پروتئین‌های آن‌ها را می‌توان به راحتی با استفاده از مواد شوینده مانند سدیم دودسیل سولفات (SDS) استخراج کرد، جای تعجب نیست که گلبول‌های قرمز پستانداران به موضوع تحقیقاتی مورد علاقه بیوشیمی‌دانان و زیست‌شناسان سلولی تبدیل شده‌اند.

ساختار غشای پلاسمایی در نتیجه، می توان گفت که پروتئین های غشایی گلبول های قرمز پستانداران شناخته شده ترین پروتئین در بین هر سلول است.

آنها را خواهید دید که به تفصیل مورد بحث قرار گرفته و در صفحاتی در بیولوژی سلولی مولکولی (نسخه دوم) توسط دارنل و همکاران نشان داده شده است. و در صفحات بیوشیمی (ویرایش سوم) توسط استایر. هنگامی که پروتئین های غشایی گلبول های قرمز پستانداران تحت SDS-PAGE قرار می گیرند و با Coomassie Brilliant Blue R رنگ آمیزی می شوند، همانطور که در این تمرین انجام می دهید، تقریباً 10 نوار اصلی قابل مشاهده است.

این نوارهای اصلی با باند 1، بزرگترین پروتئین در بالای ژل، شماره گذاری شده اند. باندهای 1 و 2 مونومرهای α (وزن مولکولی 240 کیلو دالتون) و β (220 کیلو دالتون) اسپکترین هستند، یک پروتئین غشایی محیطی که در صورت سیتوپلاسمی قرار دارد. اسپکترین، یک پروتئین رشته ای طولانی که به عنوان یک دایمر αβ وجود دارد، به عنوان یک جزء اصلی از اسکلت سلولی عمل می کند.

نوارهای الکتروفورز پلی آکریل آمید 2.1 و 2.2 آنکیرین

یکی دیگر از پروتئین های غشای محیطی هستند که در سمت سیتوپلاسمی قرار دارند. Ankyrin، یک پروتئین کروی با وزن مولکولی تقریبا 200 کیلو دالتون، نیز جزء اسکلت سلولی است. آنکیرین دارای دو حوزه اتصال است: یکی برای اسپکترین و دیگری برای پروتئین باند گذرنده 3. بنابراین، برای اتصال کابل های اسپکترین به سمت داخلی غشای گلبول قرمز عمل می کند.

پروتئین باند 3 اولین پروتئین از دو پروتئین اصلی غشایی است. این ماده به صورت دایمر از دو زنجیره یکسان وجود دارد که هر کدام با 929 باقیمانده اسید آمینه دارای وزن مولکولی تقریباً 93 کیلو دالتون هستند. هر مونومر شامل یک دامنه C ترمینال (509 باقیمانده) است که در دولایه فسفولیپیدی غشاء قرار دارد و یک دامنه N ترمینال (420 باقیمانده) که به داخل سیتوپلاسم گلبول های قرمز گسترش می یابد. پروتئین باند 3 یک پروتئین گذرنده چند پاسی است.

دامنه C ترمینال گذرنده آن دوازده بار از غشای گلبول قرمز وارد و خارج می شود.

پروتئین باند 3 به عنوان یک کانال آنیونی عمل می کند (منفذی از طریق غشاء که از طریق آن می توان آنیون هایی مانند کلرید و بی کربنات را مبادله کرد). علاوه بر عملکرد انتقال، پروتئین باند 3 دارای یک دامنه اتصال آنکیرین در انتهای N سیتوپلاسمی خود است. بنابراین، مولکول های باند 3 به عنوان مکان هایی عمل می کنند که اسکلت سلولی به آن متصل است. پروتئین باند 3 به وفور در غشای گلبول قرمز وجود دارد.

تقریباً یک سوم کل پروتئین غشایی را شامل می شود.

پروتئین باند 3 نیز یک گلیکوپروتئین است که باقی مانده الیگوساکارید کوچکی را در حوزه خارجی خود حمل می کند. پروتئین باند 4.1، تقریباً 82 کیلو دالتون وزن مولکولی، یکی دیگر از پروتئین های غشایی محیطی روی سطح سیتوپلاسمی غشاء و جزء دیگر اسکلت سلولی است. این یک پروتئین کروی با دو حوزه اتصال است: یکی برای اسپکترین و دیگری برای اکتین. پروتئین باند 5 اکتین است، یک پروتئین کروی با وزن مولکولی 43 کیلو دالتون.

اکتین یکی دیگر از پروتئین های غشای محیطی در سمت سیتوپلاسمی است که در اسکلت سلولی شرکت می کند. مونومرهای اکتین برای تشکیل رشته ها پلیمریزه می شوند و در اسکلت سلولی در محل اتصال کابل های اسپکترین که توسط پروتئین باند 4.1 به آنها متصل می شوند، شرکت می کنند.

پروتئین باند 6 گلیسرآلدهید-3-فسفات دهیدروژناز است، آنزیمی که تبدیل گلیسرآلدئید-3-فسفات به 1،3-بیس فسفوگلیسرات را کاتالیز می کند. این یکی از آنزیم های اصلی در مسیر گلیکولیتیک، مجموعه ای از واکنش های بیوشیمیایی است که در انرژی زیستی سلولی دخیل است. گلیسرآلدهید-3-فسفات دهیدروژناز یک پروتئین تترامری با وزن مولکولی 140 کیلو دالتون است.

هر یک از چهار زیرواحد یکسان آن از یک زنجیره پلی پپتیدی منفرد (35 کیلو دالتون) از تقریباً 330 باقیمانده اسید آمینه تشکیل شده است.

یکی از آخرین پروتئین های غشایی که باید ذکر شود گلیکوفورین است، دومین پروتئین از دو پروتئین اصلی غشایی. گلیکوفورین در دنباله شماره گذاری نمی شود زیرا با کوماسی آبی رنگ نمی شود. از 131 باقی مانده اسید آمینه با وزن مولکولی تقریبا 30 کیلو دالتون تشکیل شده است.

این یک پروتئین غشایی تک گذر است، یعنی زنجیره پلی پپتیدی فقط یک بار از لایه دوگانه فسفولیپیدی عبور می کند. پایانه آمینه آن (حدود 70 باقی مانده اسید آمینه) در سمت خارجی غشای گلبول قرمز قرار دارد. این حوزه خارجی به شدت با باقی مانده های کربوهیدرات های متعدد گلیکوزیله شده است، این قندها 64 درصد وزن مولکولی پروتئین خالص شده را تشکیل می دهند. مطالعه دقیق خلاصه بالا نشان می دهد که چیزی در مورد هویت باندهای 4.2، 4.9 و 7 پروتئین که در شکل در زیست شناسی سلولی مولکولی نشان داده شده است، نوشته نشده است.

این به این دلیل است که عملکرد این پروتئین ها هنوز کشف نشده است. علاوه بر این، پروتئین‌ها، آدوسین و تروپومیوزین، که به عنوان اجزای مهم اسکلت سلولی گلبول قرمز در شکل در زیست‌شناسی سلولی مولکولی نشان داده شده‌اند نیز ذکر نشده‌اند. این به این دلیل است که به نظر نمی رسد این پروتئین ها به اندازه کافی فراوان باشند تا به طور معمول در ژل های SDS-PAGE وجود داشته باشند.

الکتروفورز پلی آکریل آمید 21 پروتئین های سیتوپلاسمی تخمین زده شده است

که سیتوپلاسم یک سلول پستانداران معمولی حاوی آنزیم ها، پروتئین های تنظیم کننده و پروتئین های ساختاری (یعنی اسکلت سلولی) حدود چند صد نوع مختلف از مولکول های پروتئینی است. سیتوپلاسم گلبول قرمز، با این حال، از دو جنبه منحصر به فرد است.

اولاً، محتوای پروتئین بالاتری نسبت به سلول های سوماتیک معمولی دارد. دوم، تقریباً 75 درصد از این پروتئین هموگلوبین (زیر واحدهای 15 کیلو دالتون) است، رنگدانه تنفسی که عملکرد اصلی آنها را به گلبول های قرمز (انتقال اکسیژن و دی اکسید کربن در سراسر بدن) می دهد.

درصد باقیمانده شامل انواع مختلفی از آنزیم‌ها، مولکول‌های ساختاری و مولکول‌های تنظیم‌کننده است،

اما بسیاری از پروتئین‌هایی که معمولاً در سلول‌های سوماتیک وجود دارند در گلبول‌های قرمز یافت نمی‌شوند. آنها همراه با هسته در فرآیند بلوغ گلبول قرمز از بین می روند.

رسوب کسری رسوب کسری تکنیکی است که به حلالیت های متفاوت مولکول های مختلف در یک محلول بستگی دارد. تا به حال، شما با مفاهیم آبگریزی و آب دوستی بسیار آشنا هستید زیرا به زنجیره های جانبی اسیدهای آمینه، اسیدهای چرب، سر و دم فسفولیپیدها و به طور کلی به مولکول های آلی مربوط می شود. همچنین با مفهوم شکل کلی و قطبیت مولکول های آب آشنا هستید که اتم های هیدروژن نسبتا مثبت و اتم اکسیژن نسبتا منفی هستند.

بنابراین، شما هیچ مشکلی در تشخیص این موضوع نخواهید داشت که وقتی مولکول ها در آب حل می شوند (و فراموش نکنید که همه موجودات زنده اساساً مخلوط های بسیار سازمان یافته ای از مولکول های آلی هستند که در آب حل شده و توسط غشاء احاطه شده اند)، هر مولکول توسط غشاء احاطه می شود. پوسته ای از مولکول های آب که جهت گیری به سمت املاح به گونه ای است که انرژی آزاد حداکثر است.

این پدیده به عنوان حلالیت شناخته می شود.

مولکول‌ها یا گروه‌های یونی و مولکول‌ها یا گروه‌های قطبی ممکن است توسط پوسته‌ای متشکل از چندین لایه از مولکول‌های آب که به‌طور خاص سازماندهی شده‌اند حل شوند، در حالی که مولکول‌هایی که در مقیاس آبگریز-آب دوست در میانه راه هستند، ممکن است با پوسته‌های بسیار نازک مولکول‌های آب حل شوند که تا حدودی تصادفی هستند.

جهت دار و بسیار شل نگه داشته شده است. پس از تثبیت این مفهوم که مولکول‌ها در محلول‌های آبی توسط پوسته‌های مولکول‌های آب حل می‌شوند، نتیجه می‌شود که این پوسته‌ها برای جلوگیری از تماس مولکول‌های محلول با یکدیگر عمل می‌کنند و علاوه بر این، هر تغییری در محیط آبی که باعث اختلال در محیط می‌شود.

پوسته‌ها با نازک‌کردن یا از بین بردن آن‌ها به طوری که تک تک مولکول‌های املاح بتوانند با یکدیگر تماس بگیرند، ممکن است به املاح اجازه دهد که محکم‌تر از نگه داشتن مولکول‌های آب به هم بچسبند. ممکن است خوشه های غول پیکر تشکیل شوند و آنها به صورت رسوب در محلول ته نشین شوند. این در اصل چیزی است که در بارش کسری اتفاق می افتد. چگونه می توان محیط آبی را به گونه ای تغییر داد که پوسته ها مختل شوند؟

سه راه اصلی وجود دارد:

تغییر ph، اضافه کردن نمک، یا اضافه کردن یک حلال آلی قابل امتزاج با آب. این دومین و سومین تکنیک از این سه تکنیک است که در این تمرین آزمایشگاهی استفاده خواهید کرد. رسوب کسری پروتئین ها با افزودن یک نمک به عنوان نمک زدایی شناخته می شود.

در تئوری، هر نمکی که اجزای یونی آن به طور برگشت‌ناپذیر با پروتئین‌ها واکنش نمی‌دهند و دناتوره نمی‌کنند، ممکن است مورد استفاده قرار گیرد، اما در عمل، سولفات آمونیوم، (NH 4 ) 2 SO 4، نمک انتخابی است. سولفات آمونیوم بسیار محلول در آب است. برای تولید محلول اشباع شده باید به ازای هر لیتر آب 767 گرم اضافه کرد.

بنابراین، محدوده وسیعی وجود دارد که غلظت آن را می توان تغییر داد. همچنین، هم یون های آمونیوم و هم یون های سولفات به شدت حل می شوند. بنابراین، آنها در جدا کردن مولکول‌های آب از پروتئین‌های حل‌شونده پوسته بسیار مؤثر هستند. در این تمرین، محلول اشباع سولفات آمونیوم را با حجم مساوی از پلاسما در دمای اتاق رقیق می کنید. مخلوط حاصل خواهد شد

الکتروفورز پلی آکریل آمید در سطح اشباع 50 درصد باشد.

در این شرایط، انتظار می رود که گلوبولین ها رسوب کنند اما آلبومین در محلول باقی بماند. رسوب کسری پروتئین ها با افزودن یک حلال آلی قابل امتزاج با آب مانند اتانول به دلیل تغییر در ثابت دی الکتریک (ε) محلول رخ می دهد.

ثابت دی الکتریک مقداری است که قدرت نیروی اعمال شده توسط یک بار الکتریکی بر دیگری را توصیف می کند. به یاد دارید که مولکول های آب ساختارهای قطبی هستند و بارهای درون مولکولی آنها بر سایر مولکول های آب و املاح محلول مانند پروتئین ها نیرو وارد می کند. (در واقع این نیروهای بین مولکولی هستند که منجر به پدیده حلال‌پذیری می‌شوند که در پاراگراف‌های قبل توضیح داده شد.) وقتی حلال‌های آلی نسبتاً غیرقطبی مانند متانول، اتانول و پروپانول با آب مخلوط می‌شوند، برای جدا کردن مولکول‌های آب از آب عمل می‌کنند.

همدیگر را کاهش دهند و در نتیجه نیرویی را که می توانند به یکدیگر وارد کنند کاهش دهند. برای آب خالص، ε = 80 statcoulomb 2 /dyne-cm 2 در حالی که برای اتانول خالص، ε = 32 statcoulomb 2 /dyne-cm 2 (هر دو مقادیر تقریبی هستند). افزودن مقادیر فزاینده اتانول به محلول آبی پروتئین ها به تدریج ثابت دی الکتریک را کاهش می دهد و در نهایت با حلالیت پروتئین تداخل می کند تا جایی که برهمکنش پروتئین-پروتئین قوی تر از برهمکنش پروتئین آب می شود و پروتئین ها رسوب می کنند.

در این تمرین، اتانول مطلق را به نسبت 1:2 (vol:vol) در دمای 0 درجه سانتیگراد به پلاسما اضافه می کنید. مخلوط حاصل 33 درصد اتانول با ثابت دی الکتریک تقریباً 60 خواهد بود. در این شرایط، انتظار می رود که گلوبولین ها رسوب کنند اما آلبومین در محلول باقی بماند. SDS-PAGE SDS-PAGE مخفف روش الکتروفورز است که در آن از ژل پلی آکریل آمید به عنوان ماده ماتریکس استفاده می شود و ماده شوینده، سدیم دودسیل سولفات، در بافر الکتروفورز گنجانده شده است.

ارتباط این دو ماده با حرکت مولکول های باردار (در مورد ما پروتئین ها) در میدان الکتریکی چگونه است؟

برای شروع، اگر به سادگی یک لوله شیشه‌ای U شکل را بگیرید، آن را با محلول پروتئینی در یک بافر مناسب پر کنید، یک کاتد در یک بازوی لوله و یک آند در دست دیگر قرار دهید و یک جریان الکتریکی اعمال کنید، پروتئین‌ها در محلول شروع به مهاجرت در میدان الکتریکی می کند.

پس از مدتی، غلظت پروتئین‌های مختلف در بخش‌های مختلف لوله دیگر یکنواخت نخواهد بود:

گونه‌های دارای بار مثبت بیشتر در بازوی کاتدی متمرکز می‌شوند در حالی که گونه‌های دارای بار منفی در بازوی آند بیشتر متمرکز می‌شوند. هر گونه جداسازی به دست آمده بسیار ناپایدار خواهد بود، با این حال، به محض قطع جریان، اگر دستگاه حرکت نمی کرد تا مولکول های جدا شده به طور فیزیکی مخلوط شوند، به سرعت به موقعیت های تصادفی خود به دلیل انتشار باز می گردند.

بنابراین، برای اینکه الکتروفورز عملی باشد، محققان باید راهی پیدا می‌کردند که از طریق آن مولکول‌های جدا شده را بعد از جدا شدن از هم جدا نگه دارند. این مشکل فنی زمانی حل شد که روش‌هایی برای انجام فرآیند الکتروفورتیک در یک ماتریس متخلخل ایجاد شد. کاغذ اولین ماده ای بود که به عنوان ماده ماتریکس مورد استفاده قرار گرفت.

کاغذ با بافر اشباع شده بود، یک مخلوط پروتئین در یک مبدأ مانند کروماتوگرافی لایه نازک اعمال شد (به جز اینکه مبدا معمولاً در وسط ورق بود نه در یک انتها)، و ورق روی آن پوشانده شد

یک میله نگهدارنده که انتهای آن در دو حمام بافر فرو رفته است: یکی حاوی کاتد و دیگری آند. برای جلوگیری از خشک شدن کاغذ، کل سیستم در یک محفظه هوا محصور شده بود.

یک سیستم مرتبط، الکتروفورز استات سلولز، از یک لایه نازک از استات سلولز اشباع شده با بافر بر روی یک پوشش پلاستیکی محصور در یک محفظه مشابه استفاده کرد. هر دوی این سیستم‌ها به خوبی کار می‌کردند، اما اجرای آنها از نظر فنی دشوار بود، زیرا محافظت از کاغذ یا لایه استات سلولز حداقل تا حدودی دشوار بود، و به زودی با سیستم‌های ماتریس ژل که بسیار راحت‌تر هستند جایگزین شدند. ژل نشاسته اولین ماتریس ژلی بود که برای الکتروفورز استفاده شد. بعدها، ژل های آگارز و ژل های پلی آکریل آمید ترجیح داده شدند. ژل ها در یک بستر افقی یا الکتروفورز پلی آکریل آمید 23 یک بستر عمودی (شکل 2.1).

از آنجایی که تخت‌های ژل می‌توانند محصور شوند، خشک شدن و گرمایش همزمان که جریان الکتریکی از یک محیط خشک‌کننده فزاینده عبور می‌کند، هرگز مشکلی ایجاد نمی‌کند.

شیمی تشکیل پلی آکریل آمید در شکل 2.2 نشان داده شده است. آکریل آمید مولکول مونومری است که پلیمریزه می شود، N,N-متیلن-بیس-اکریلامید (که به سادگی به عنوان bis شناخته می شود) مولکول اتصال عرضی است که با آکریل آمید هم پلیمریزه می شود و پرسولفات آمونیوم (NH 4 ) 2 S 2 O 8 و N،N،N،N-tetramethylethylenediamine (TEMED) کاتالیزورهای پلیمریزاسیون هستند.

با تغییر مقدار آکریل آمید در مخلوط پلیمریزاسیون، می توان میزان اتصال عرضی در پلیمر را تغییر داد. کاهش درجه اتصال متقابل منجر به افزایش اندازه متوسط ​​منافذ درون ماتریس پلی آکریل آمید می شود و این به طور مستقیم بر سرعت حرکت مولکول های با اندازه های مختلف در ماتریس تأثیر می گذارد. بنابراین، می توان غلظت پلی آکریل آمید را انتخاب کرد که به بهترین وجه پروتئین خاصی را که به آن علاقه مند است، حل می کند. شکل 2.1. نمودار دستگاه آزمایشی برای الکتروفورز پلی آکریل آمید دال-ژل.

الکتروفورز پلی آکریل آمید شکل 2.2. شیمی پلیمریزاسیون ژل های پلی آکریل آمید.

اساس نظری فرآیند الکتروفورتیک را می‌توان به صورت زیر توصیف کرد: حرکت یک مولکول باردار در یک میدان الکتریکی با معادله Ez=fv توصیف می‌شود که در آن E نیروی میدان الکتریکی (بر حسب ولت بر سانتی‌متر) و z برابر است.

بار خالص روی مولکول، v سرعت حرکت مولکول (بر حسب سانتی متر بر ثانیه) و f یک ضریب اصطکاک است که به اندازه و شکل مولکول بستگی دارد. با تنظیم مجدد معادله، v = E ze z = fv یا v = E f بر این نکته تأکید می کند که سرعت، v، متناسب با شدت میدان الکتریکی، E، و بار خالص مولکول، z، و نسبت معکوس است. به ضریب اصطکاک، f. بنابراین، هرچه میدان الکتریکی قوی‌تر و بار خالص بیشتر باشد، مولکول سریع‌تر حرکت می‌کند، در حالی که هرچه شکل آن بزرگ‌تر و/یا نامتقارن‌تر باشد، نیروی اصطکاک یا کشش zf را کاهش می‌دهد.

الکتروفورز پلی آکریل آمید 25 آن را پایین بیاورید. از آنجایی که وزن مولکولی جزء مهمی از ضریب اصطکاک است، f، عبارت (z/f) به عنوان نسبت بار به جرم یا چگالی بار گفته می شود. این معادله همچنین به ما امکان می دهد رفتار دو مولکول باردار مختلف را در یک میدان الکتریکی مقایسه کنیم.

از آنجایی که اثر میدان الکتریکی بر روی دو گونه مولکولی مختلف یکسان خواهد بود، تفاوت در v باید به دلیل تفاوت در z/f باشد، نسبت بار به جرم دو مولکول مورد نظر. این نکته را می توان با تعریف پارامتر دیگری، تحرک الکتروفورتیک (µ)، سرعت در واحد میدان الکتریکی، v E = zf نشان داد، بنابراین، تحرک الکتروفورتیک دو پروتئین مختلف، µ1 در مقابل µ2، در یک میدان الکتریکی مشابه خواهد بود. متناسب با تفاوت بین چگالی بار یا نسبت بار به جرم دو گونه مولکولی باشد.

تحرک الکتروفورتیک (µ)، مانند وزن مولکولی، ویژگی فیزیکی هر گونه مولکولی متفاوت است.

با این حال، توجه داشته باشید که برخلاف وزن مولکولی، این یک ثابت فیزیکی نیست، بلکه یک ویژگی متغیر است که به ph محلولی که مولکول در آن حل شده است بستگی دارد. در حالی که ماهیت و تعداد گروه های قابل یونیزاسیون در یک مولکول یک ویژگی ثابت ساختار مولکولی آن است، یونیزه بودن یا نبودن این گروه ها به ph محلول بستگی دارد.

بنابراین، z، بار خالص روی یک مولکول، تابعی از ph است. یک قانون کلی این است که با کاهش ph، z مثبت‌تر می‌شود و درک کلی شما از فرآیند یونیزاسیون در ارتباط با مولکول‌های آلی باید به گونه‌ای باشد که بتوانید توضیح دهید که چرا چنین است. جهت مهاجرت نیز به بار خالص مولکولی بستگی دارد.

گونه های با بار مثبت (یعنی کاتیون ها) به سمت کاتد (یعنی الکترود با بار منفی) حرکت می کنند، در حالی که گونه های دارای بار منفی (یعنی آنیون ها) به سمت آند حرکت می کنند. یک نکته نهایی باقی مانده است که باید مورد بحث قرار گیرد: تفاوت بین PAGE (الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید معمولی) و SDS-PAGE (الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید با SDS در بافر.

شما قبلاً با نقش مواد شوینده مانند SDS در استخراج پروتئین های غشایی انتگرال آشنا هستید (برای تازه کردن حافظه خود به صفحات زیست شناسی سلولی مولکولی مراجعه کنید). شما از این تکنیک برای حل کردن پروتئین های غشای گلبول قرمز در این تمرین استفاده خواهید کرد. تحرک های الکتروفورتیک به طور قابل توجهی با پروتئین های دست نخورده متفاوت است.

دلیل آن این است که SDS ساختار ثانویه مولکول ها را مختل می کند و به پلی پپتیدها متصل می شود به همان روشی که پروتئین های غشایی یکپارچه را احاطه کرده و آنها را از موقعیت های ترمودینامیکی راحت خود در لایه دولایه لیپیدی خارج می کند.

مقدار SDS متصل به واحد وزن پروتئین ثابت است

(1.4 گرم S DS به ازای هر گرم پروتئین) و در نتیجه، چگالی بار (یعنی مقادیر z/f) همه پروتئین‌ها یکسان می‌شوند و بار توسط SDS متصل شده به جای گروه‌های R پروتئین ایجاد می‌شود. تحت این شرایط، تحرک الکتروفورتیک به دلیل خاصیت الک مولکولی ژل پلی آکریل آمید، تابعی از وزن مولکولی است.

به عبارت دیگر، مولکول های کوچکتر سریعتر از مولکول های بزرگتر در منافذ ژل حرکت می کنند. هنگامی که فاصله مهاجرت شده به عنوان تابعی از وزن مولکولی لگاریتم ترسیم می شود، یک خط مستقیم مانند آنچه در شکل 2.3 نشان داده شده است، به دست می آید. بنابراین، SDS-PAGE نه تنها پروتئین‌های مختلف را در یک مخلوط جدا می‌کند، بلکه تخمین دقیقی از وزن مولکولی آنها نیز ارائه می‌کند. = µ

الکتروفورز پلی آکریل آمید  وزن مولکولی

به عنوان تابعی از فاصله برای پروتئین‌های مختلف که در مخلوط‌های استاندارد برای این تمرین در دسترس خواهند بود مهاجرت کرد. اقدامات احتیاطی ایمنی رویه های آزمایشگاهی روز 1 1. خطر! خطر شوک! اگرچه دستگاه الکتروفورز مجهز به درب ایمنی است، اما همیشه باید با احتیاط کار کرد. برخورد بی دقت می تواند منجر به شوک الکتریکی دردناک (اما نه کشنده) شود.

آکریل آمید و بیس نوروتوکسین های قوی هستند

که به صورت خالص (یعنی پودر) یا محلول در آب به راحتی از طریق ریه ها و همچنین از طریق پوست جذب می شوند. با این حال، مجبور نخواهید بود با این مواد سر و کار داشته باشید، زیرا ژل شما توسط کارکنان آماده سازی برای شما ریخته می شود. پلی آکریل آمید سمی نیست، اما از آنجایی که برخی از مونومرهای پلیمریزه نشده ممکن است هنوز در ژل وجود داشته باشند، هنگام کار با ژل یا شستن ظروف شیشه ای که با آکریل آمید تماس دارند، باید همیشه از دستکش های لاستیکی یکبار مصرف استفاده کرد. 3. هنگام استفاده از حمام آب جوش مراقب باشید که از سوختگی جلوگیری کنید.

الکتروفورز پلی آکریل آمید پم

27 قسمت 1: جداسازی خون به بخش های سلولی و پلاسما 1. لوله سانتریفیوژ کالیبره شده 12 میلی لیتری حاوی 10 میلی لیتر خون پستانداران را از سطل یخ خود خارج کنید. نمای بیرونی آن را با کیم‌ویپ خشک کنید و آن را در یکی از سطل‌های یک سانتریفیوژ بالینی یخچال قرار دهید. اگر نمی توانید لوله خود را با لوله متعلق به یک جفت دانش آموز دیگر متعادل کنید، یک لوله تعادل پر از آب تهیه کنید تا در سطل طرف مقابل روتور سانتریفیوژ قرار دهید. 2. به مدت 5 دقیقه با حداکثر سرعت سانتریفیوژ کنید. 3. با یک پیپت پاستور پلاستیکی، یک پیپت پر از پلاسمای رویی را به دقت داخل لوله آزمایش بکشید. مراقب باشید که سلول های رسوب شده را تحریک نکنید. برچسب Pl.

لوله را در سطل یخ خود نگهداری کنید

تا زمانی که بعدا مورد نیاز باشد. بقیه مایع رویی را با پیپت پاستور خود خارج کرده و آن را در ظرف پلاستیکی زباله بریزید. 4. 6 میلی لیتر بافر شستشوی ایزوتونیک سرد یخ (150 میلی متر کلرید سدیم + 5 میلی متر فسفات سدیم میلی متر EDTA، ph 7.4) را از یک ریپیپتر به سلول های پلت شده اضافه کنید. سلول ها را با پارافیلم بپوشانید و به آرامی ورتکس کنید تا به طور یکنواخت با بافر شستشو مخلوط شوند. 5. به اندازه کافی بافر اضافه کنید تا لوله با دیگری متعادل شود و دوباره با حداکثر سرعت به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید. 6. بافر شستشوی مایع رویی را به یک لیوان زباله پلاستیکی بریزید. 7. مرحله 4 را تکرار کنید.

قسمت 2: جداسازی پروتئین های سلولی 1. یک نوک آبی با سوراخ بزرگ را روی پیپتر اپندورف 1000 میکرولیتری قرار دهید. 1000 میکرولیتر (یعنی 1 میلی لیتر) از سلول های بسته بندی شده را به دقت داخل نوک آن بکشید. 2. سلول ها را در 19 میلی لیتر بافر همولیز هیپوتونیک سرد یخ (5 میلی متر فسفات سدیم میلی متر EDTA، ph 8) در یک لوله سانتریفیوژ پلی کربنات 50 میلی لیتری که می توانید در سطل یخ خود پیدا کنید، خارج کنید. در صورت لزوم، نوک آن را با کشیدن بافر همولیز به دقت در آن چندین بار بشویید. 3. با پارافیلم بپوشانید و به شدت گرداب کنید. 4. با افزودن چند قطره بافر همولیز سرد شده به لوله فندک، لوله سانتریفیوژ خود را با لوله گروه دیگر متعادل کنید. به یاد داشته باشید که قبل از متعادل کردن لوله سانتریفیوژ خود را از بیرون خشک کنید. سپس بلافاصله آن را در روتور سانتریفیوژ قرار دهید.

سلول های همولیز شده را با سرعت 14000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه بچرخانید تا غشاها پلت شوند.

در این مدت، مرحله قسمت را ادامه دهید وقتی روتور متوقف شد، به آرامی لوله خود را بردارید. ارواح یک گلوله بسیار شل تشکیل می دهند، بنابراین باید با دقت لوله را کنترل کنید وگرنه آنها را دوباره معلق خواهید کرد. (الف) با یک پیپت پاستور پلاستیکی، یک پیپت پر از مایع رویی قرمز روشن را با دقت از بالای لوله خارج کنید. آن را به لوله آزمایش انتقال دهید. این بخش پروتئین سیتوپلاسمی شما خواهد بود. روی آن برچسب Cy بزنید و در سطل یخ خود ذخیره کنید. (ب) در مرحله بعد، بقیه مایع رویی را با احتیاط در ظرف پلاستیکی ریخته کنید. به یاد داشته باشید که گلوله را روی گلوله بریزید تا به داخل لوله نریزد و همراه با آن از لوله خارج نشود

مایع رویی الکتروفورز پلی آکریل آمید

اگر این کار را با موفقیت انجام دهید، کسر ارواح (G) شما به عنوان یک گلوله شل در انتهای لوله سانتریفیوژ شما باقی می‌ماند. ممکن است لازم باشد بافر باقیمانده را با پیپت پاستور پلاستیکی حذف کنید. (ج) 10 میلی لیتر بافر همولیز سرد یخی را از یک رپیپتر به گلوله اضافه کنید و به آرامی با یک پیپت پاستور پلاستیکی مخلوط کنید. بالانس کنید و به مدت 10 دقیقه با 14000 دور در دقیقه بچرخانید. مایع رویی را تخلیه کنید و گلوله کسر روح (G) شما است.

بخش 3: تکه تکه کردن پروتئین های پلاسما با نمک زدن 1. به 250 میکرولیتر سولفات آمونیوم اشباع شده در یک لوله میکروسانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری (با برچسب A)، 250 میکرولیتر پلاسما را با پیپتر اپندورف 250 میکرولیتری اضافه کنید. 2. پوشش لوله میکرو سانتریفیوژ را ببندید و به طور مختصر اما کاملاً گرداب کنید. سپس به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری کنید. 3. 3 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید. (مطمئن شوید که لوله شما با لوله دیگری متعادل است.) هنگامی که لوله میکرو سانتریفیوژ خود را در روتور قرار می دهید، آن را با لولا به سمت مرکز روتور قرار دهید. این به شما امکان می دهد تا روی گلوله تخلیه کنید و در نتیجه احتمال جدا شدن گلوله های شل با مایع رویی را کاهش دهید.

مایع رویی را با دقت به داخل لوله آزمایشی میلی لیتر بریزید.

برچسب As را بزنید و در سطل یخ خود ذخیره کنید. یک کیم‌ویپ را بچرخانید و آن را در لوله میکرو سانتریفیوژ قرار دهید تا آخرین ماده رویی از بالای پروتئین‌های رسوب‌شده با عمل مویرگی خارج شود. 5. از یک پیپتر تکراری، 1 میلی لیتر سولفات آمونیوم نیمه اشباع را به رسوب اضافه کنید تا آخرین آثار مایع رویی شسته شود. با آسپیراسیون مکرر با پیپت پاستور پلاستیکی دوباره معلق کنید. 6. دوباره همانطور که در بالا توضیح داده شد سانتریفیوژ کنید. مایع رویی شستشو را به لیوان زباله پلاستیکی بریزید. آخرین قطره را با Kimwipe پیچ خورده بردارید. رسوب کسر Ap شما خواهد بود. آن را در سطل یخ خود ذخیره کنید.

بخش 4: تقسیم پروتئین های پلاسما با رسوب اتانول 1. به 250 میکرولیتر اتانول مطلق سرد در یک لوله میکروسانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری (با برچسب E)، 500 میکرولیتر پلاسما را با پیپتر اپندورف 500 میکرولیتری اضافه کنید.

2. درب لوله میکرو سانتریفیوژ را ببندید و به طور مختصر اما کاملاً ورتکس کنید. سپس به مدت 5 دقیقه در سطل یخ خود نگهداری کنید. 3. 3 دقیقه در یک میکروسانتریفیوژ یخچالی سانتریفیوژ کنید. (مطمئن شوید که لوله شما با یک لوله دیگر متعادل است.) برچسب Es را بزنید و در سطل یخ خود ذخیره کنید. یک کیم‌ویپ را بچرخانید و آن را در لوله میکرو سانتریفیوژ قرار دهید تا آخرین ماده رویی از بالای پروتئین‌های رسوب‌شده با عمل مویرگی خارج شود. 5. از یک پیپتر تکراری، 1 میلی لیتر اتانول 50 درصد سرد شده را به رسوب اضافه کنید تا آخرین آثار مایع رویی شسته شود. با آسپیراسیون مکرر با پیپت پاستور پلاستیکی دوباره معلق کنید. سعی کنید این کار را سریع انجام دهید تا با گرمای انگشتان آماده سازی خود را گرم نکنید.

15 الکتروفورز پلی آکریل آمید مجدداً در میکروسانتریفیوژ یخچالی همانطور که در بالا توضیح داده شد سانتریفیوژ کنید. مایع رویی شستشو را به لیوان زباله پلاستیکی بریزید. آخرین قطره را با Kimwipe پیچ خورده بردارید. رسوب کسر Ep شما خواهد بود. آن را در سطل یخ خود ذخیره کنید. قسمت 5: آماده سازی نمونه ها برای SDS-PAGE 1. حرارت صفحه داغ خود را زیاد کنید تا زمانی که نمونه های شما آماده شد، آب در حال جوشیدن باشد. 2. از یک پیپتر تکراری، 450 میکرولیتر نمونه بافر (80 میلی متر Tris mm DTT + 2% SDS) را به هر یک از چهار لوله میکرو سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری اضافه کنید.

(الف) با یک پیپتر 50 میکرولیتری اپندورف، 50 میکرولیتر از سه بخش مایع (پروتئین های سیتوپلاسمی، سولفات آمونیوم رویی و مایع رویی اتانول) هر کدام را به یک لوله میکروسانتریفیوژ متفاوت اضافه کنید. Cy، As و Es را برچسب بزنید. با ضربه زدن به کناره لوله به آرامی مخلوط کنید. (ب) با یک پیپتر اپندورف 50 میکرولیتری و یک نوک زرد با سوراخ گشاد، 50 میکرولیتر ارواح را به یک لوله میکروسانتریفیوژ اضافه کنید. برچسب G. 3. 900 میکرولیتر نمونه بافر را به دو لوله میکروسانتریفیوژ حاوی رسوبات سولفات آمونیوم و اتانول (به ترتیب Ap و Ep) اضافه کنید. درب ها را ببندید و این دو لوله را ورتکس کنید تا رسوبات کاملاً با بافر نمونه مخلوط شوند. اگر در تعلیق مجدد گلوله با مشکل مواجه شدید، از پیپتر اپندورف 1000 میکرولیتری (با نوک) برای شکستن گلوله استفاده کنید.

لوله های میکرو سانتریفیوژ را در یک قفسه در حمام آب در حال جوش قرار داده و به مدت 5 دقیقه بجوشانید.

فقط نوک لوله ها باید با آب جوش در تماس باشد. حرارت را طوری تنظیم کنید که آب زیاد به جوش نیاید. 5. لوله های میکرو سانتریفیوژ خود را از حمام آب در حال جوش خارج کنید، قسمت بیرونی آن ها را با کیم وایپ خشک کنید و به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید تا مواد نامحلول که ممکن است در حین جوشیدن رسوب کرده باشند گلوله شوند.

نمونه های شما اکنون آماده بارگیری در چاهک های مناسب ژل هستند. مراقب باشید که رسوبات را قبل از بارگیری بهم نزنید. قسمت 6: بارگیری ژل و انجام الکتروفورز 1. دستگاه ژلی که شما استفاده می کنید از جدیدترین طراحی است که معمولاً به آزمایشگاه های تحقیقاتی فروخته می شود. ژل شما توسط کارکنان آماده سازی برای شما ریخته گری شده و در دستگاه ژل نصب می شود. با این حال، باید تنظیمات خود را بررسی کنید تا بفهمید چگونه در کنار هم قرار گرفته است.

(الف) پوشش ایمنی را که با بلند کردن به عقب باز می شود را شناسایی کنید تا بتوانید با دستگاه کار کنید. پست های اتصال را در جایی که سرنخ های الکتریکی وصل شده اند پیدا کنید. توجه داشته باشید که نمی‌توانید سرب‌ها را در حالی که درب باز است وصل کنید، و بنابراین، پس از روشن شدن جریان، نمی‌توانید به‌طور تصادفی انگشتان خود را در حمام‌های بافر فرو کنید. (ب) محفظه بافر بالا و پایین با بافر الکتروفورز پر می شود. در پایین هر محفظه، الکترودهای سیم پلاتینی قرار دارند که جریان را به سیستم می‌رسانند. (ج) دال ژل بین دو صفحه شیشه ای که به صورت عمودی در دستگاه بسته شده اند قرار می گیرد. جدا کننده های تفلون سفید به صورت عمودی در هر لبه دال اجرا می شوند. ساندویچ باید به طور ایمن در دستگاه بسته شود تا الکتروفورز بافر شود

الکتروفورز پلی اکریل آمید محفظه بالایی

نشتی ندارد. اگر به نظر می رسد که سیستم شما لو می رود، دستیار آموزشی خود را احضار کنید. (د) توجه داشته باشید که صفحات شیشه ای دارای ارتفاع نابرابر هستند. صفحه پشتی کوتاه تر از صفحه جلویی است و این اجازه می دهد تا قسمت پشتی ژل با بافر الکتروفورز در محفظه بالایی تماس پیدا کند. در بالای ژل، 20 چاه نمونه پیدا خواهید کرد.

در این موارد است که شما نمونه های خود را بارگذاری می کنید. از آنجایی که ژل شفاف است، دیدن چاه ها دشوار است. با استفاده از یک نشانگر، یک خط در پایین چاه ایجاد کنید تا بتوانید در حین بارگیری چاه ها را به راحتی پیدا کنید. 2. از پیپتر اپندورف 10 میکرولیتری برای بارگذاری ژل استفاده کنید. روش کار به این صورت است که هر ماده ای را که قرار است در نوک اپندورف بارگذاری شود، بکشید، نوک را زیر سطح بافر الکتروفورز بین صفحات شیشه ای و بالای چاهی که می خواهید نمونه را در آن قرار دهید وارد کنید و سپس به آرامی دکمه را فشار دهید. ، نمونه را در چاه تخلیه می کند.

از آنجایی که بافر نمونه حاوی 10 درصد گلیسرول است، متراکم تر از بافر الکتروفورز خواهد بود و می توانید شاهد افتادن نمونه از طریق بافر الکتروفورز به ته چاه باشید. (الف) شش نمونه و سه استاندارد برای بارگیری خواهید داشت. پروتکل بارگذاری داده شده در بخش Data را دنبال کنید. ترتیب را روی تکه نوار درست زیر چاه ها علامت بزنید. اطمینان حاصل کنید که دو نمونه را در یک چاه بارگذاری نکنید.

توجه داشته باشید که یک چاه خالی در سمت چپ ژل و دو چاه در سمت راست باقی مانده است تا بتوانید تشخیص دهید که در صورت برگرداندن ژل در طی مراحل رنگ‌آمیزی و رنگ‌زدایی، کدام سمت است. (ب) 10 میکرولیتر از آماده سازی های پلاسما (As، Ap، Es، و Ep) و استانداردها را بارگیری کنید. 20 میکرولیتر از فرآورده های گلبول قرمز، G و C را بارگیری کنید. 3. درب جعبه ژل را ببندید و الکترودها را وصل کنید. محل قرارگیری سرنخ های قرمز و مشکی روی جعبه مشخص شده است.

4. آمپر را در جهت عقربه های ساعت کامل و ولتاژ را روی 200 قرار دهید. در این تنظیمات تقریباً 4 ساعت طول می کشد تا ژل شما اجرا شود. 5. به شماره کد روی جعبه ژل خود توجه کنید. این شماره را در بخش داده خود ثبت کنید. به شما این امکان را می دهد که ژل خود را پس از رنگ آمیزی و لکه دار شدن شناسایی کنید. قسمت 7: رنگ‌آمیزی و رنگ‌زدایی ژل (این روش‌ها توسط پرسنل آماده‌سازی برای شما انجام می‌شود) 1. وقتی رنگ ردیاب تقریباً 2 سانتی‌متر از ته ژل رسید، منبع تغذیه را خاموش کرده و الکترودها را جدا کنید.

2. یک جفت دستکش لاستیکی بپوشید (اندازه های کوچک، متوسط ​​و بزرگ موجود است). 3. جعبه ژل خود را در حالی که قسمت پشتی آن به سمت خود است، به سمت سینک حمل کنید. درپوش ایمنی را باز کنید و بافر را از هر دو محفظه بالا و پایین داخل سینک خالی کنید. 4. به پشت میز خود برگردید، گیره های ژل را با چرخاندن دستگیره های مشکی شل کنید و ساندویچ ژل را از جعبه بردارید. 5. ساندویچ را روی کاغذ آزمایشگاهی جاذب قرار دهید و صفحه کوتاه‌تر را در بالا قرار دهید. اسپیسر را در امتداد یک لبه به سمت بیرون از بین صفحات شیشه ای بلغزانید. سپس آن را طوری بچرخانید که صفحه بالایی را از روی ژل بلند کند. شما باید نیروی قابل توجهی اعمال کنید، زیرا صفحه محکم به ژل می چسبد. وقتی بهار شل شد، هم صفحه رویی و هم اسپیسر را در ظرفی تمیز پر از آب صابون قرار دهید. سپس اسپیسر دوم را بردارید و آن را نیز داخل ظرف قرار دهید.

الکتروفورز پلی آکریل آمید با انگشتان خود

دال ژل را از صفحه زیرین به دقت شل کنید و آن را به یک جعبه پلاستیکی رنگ آمیزی ژل منتقل کنید که از قبل با محلول Coomassie Brilliant Blue R به عمق 2 سانتی متر پر شده است. جعبه رنگ آمیزی ژل خود را و آن را روی میز تلوتلو قرار دهید. 8. پس از 1 ساعت، لکه را در ظرفی برای لکه استفاده شده (برای استفاده مجدد) بریزید. محلول رنگ‌آمیزی شماره 1 را به عمق 2 سانتی‌متر اضافه کنید و جعبه خود را به میز تکان برگردانید. با از بین بردن لکه اضافی از محلول، می توان این فرآیند را تا حد زیادی کوتاه کرد. این کار را می توان با برداشتن 4 یا 5 کیم وایپ و قرار دادن آنها در محلول دفع کننده انجام داد.

(الف) پس از یک فاصله زمانی 3 4 ساعته، جعبه رنگ آمیزی خود را از روی میز تکان جدا کنید، محلول رنگ‌آمیزی را با آب سرد در سینک بریزید، آن را با محلول تازه جایگزین کنید و آن را به میز تکان برگردانید. (ب) باید مرحله بالا را دو یا سه بار برای مجموع سه تا چهار دسته محلول رنگ‌زدایی تکرار کنید. معمولاً راحت تر است که اجازه دهید یک شبه از بین برود. 9. صبح روز بعد ژل را به محلول رنگ‌آمیزی شماره 2 منتقل می‌کنید. محلول داستینینگ شماره 1 دارای درصد بالایی از متانول است و ژل تا حد زیادی منقبض می شود.

محلول داستینینگ شماره 2 دارای درصد کمی متانول است و ژل به اندازه اولیه خود باز می گردد. 10. هنگامی که ژل شما به اندازه کافی رنگ آمیزی شد، آن را در یک تکه سلفون بپیچید تا بتوانید به راحتی آن را برای ارزیابی کنترل کنید. مراحل آزمایشگاهی روز 2 اگر خودتان رنگ‌آمیزی و رنگ‌آمیزی را انجام نمی‌دهید، 2 روز به کارکنان آماده‌سازی فرصت دهید تا این روش را کامل کنند. بررسی ژل رنگ‌آمیز 1. ژل خود را همراه با یک کپی زیراکس از ژل در آزمایشگاه‌های اتاق 104 کرزپ پیدا خواهید کرد. Xerography یک کپی نسبتاً خوب از ژل تولید می کند، اگرچه ممکن است برخی از نوارهای روشن تر وجود نداشته باشند و نوارهای تیره با فاصله نزدیک ممکن است به عنوان یکی ظاهر شوند. 2. ژل سلفون‌شده و رنگ‌آلود خود را روی جعبه نور قرار دهید. نوار نوار سفید بالای ژل هویت نمونه در هر چاه را خواهد داشت.

ژل خود را با کپی زیراکس مقایسه کنید

و بر روی دومی اجزای جزئی که برای دستگاه کپی خیلی روشن هستند و نوارهای تیره وسیع که در واقع دو نوار تیره با فاصله نزدیک هستند را نشان دهید. 4. از یک خط کش میلی متری پلاستیکی برای اندازه گیری مسافتی که هر جزء طی کرده استفاده کنید. این مقادیر را در جدول در قسمت Data ثبت کنید. از ته چاه تا وسط هر نوار را اندازه بگیرید. همچنین به چگالی نسبی هر باند توجه کنید (بسیار تاریک، تاریک، روشن، بسیار روشن دسته‌های پیشنهادی هستند).

 الکتروفورز پلی آکریل آمید

5. هویت و وزن مولکولی (بر حسب kd) اجزاء در مخلوط استاندارد عبارتند از: S1: آلبومین سرم گاوی…66 آلبومین تخم مرغ…45 گلیسرآلدئید-3-فسفات دهیدروژناز…36 کربنیک انیدراز … 29 تریپسینوژن … 24 مهار کننده تریپسین سویا … 20 آلفا لاکتالبومین … 14 S2 : میوزین بتا – گالاکتوزیداز فسفوریلاز … آلبومین سرم گاوی 97 … آلبومین تخم مرغ 66 … 45 کربنیک انیدراز …29 S3: آلبومین سرم گاوی…66 نکته: این پروتئین ها فقط به عنوان استاندارد استفاده می شوند و لزوماً نشان دهنده هیچ یک از مجهولات موجود در فراکسیون های شما نیستند. گزارش آزمایشگاهی

مسافت طی شده توسط هر جزء را در استانداردها و هر نمونه را به صورت جدول خلاصه کنید.

2. با استفاده از کاغذ گراف نیمه لگاریتمی، وزن مولکولی استانداردها (بر حسب کیلو دال، در مقیاس لگاریتم) را در مقابل فاصله انتقال یافته (سانتی متر، در مقیاس خطی) رسم کنید. نمودار شما باید شبیه شکل 2.3 باشد. (الف) خطی با بهترین تناسب برای بخش خطی نمودار رسم کنید. اگر مقادیر شدید در ردیف قرار نگرفتند، خط را با بازرسی گسترش دهید. (ب) با استفاده از این منحنی استاندارد، وزن مولکولی اجزای شش نمونه خود را تخمین بزنید. از آنجایی که ممکن است اجزای بزرگ و کوچک استانداردها روی منحنی قرار نگیرند، وزن مولکولی اجزای بزرگ و کوچک در نمونه های خود را با بازرسی تخمین بزنید. این مقادیر را در جدول خود ثبت کنید.

3. با استفاده از این داده ها (به عنوان مثال، اندازه مولکولی، فراوانی مولکولی، و کسری که یک نوار در آن یافت می شود) همراه با اطلاعات داده شده در بخش پس زمینه این تمرین و در کتاب های درسی خود، در مورد هویت اجزای مختلف در هر یک حدس بزنید. از شش نمونه شما 4. در مورد (الف) کارایی مقایسه ای دو روش بارش کسری، (ب) حضور غیرمنتظره یا عدم وجود غیرمنتظره اجزای مختلف در هر نمونه، و (ج) نکات دیگری که توسط دستیار آموزشی شما نشان داده شده است، نتیجه بگیرید. 5. بخش داده شما باید در گزارش شما گنجانده شود.