مقدمه ای بر ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید با توجه به حساسیت های تشخیص آنها

مقدمه ای بر ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید با توجه به حساسیت های تشخیصی آنها پاتریشیا باریل و سیلویا ناتس موسسه ویروس شناسی دکتر JM Vanella، Facultad de Ciencias Médicas، Universidad Nacional de Córdobaculare Córdoba. تکنیک‌های زیست‌شناسی، مانند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، به طور گسترده برای کاربردهای پزشکی و پزشکی قانونی، و همچنین تحقیق و شناسایی و شناسایی ارگانیسم‌های عفونی مورد استفاده قرار گرفته‌اند.

در زمینه ویروس شناسی، نشان داده شده است که استفاده از تکنیک PCR مزایای حساسیت و تکرارپذیری بالا را در تشخیص ژنومی ویروس و خصوصیات سویه ها ارائه می دهد. با این حال، حساسیت در تشخیص قطعات DNA نیز با حساسیت ماتریس الکتروفورز اعمال شده برای توسعه محصول PCR مرتبط است. الکتروفورز از طریق ژل آگارز یا پلی آکریل آمید یک روش استاندارد است که برای جداسازی، شناسایی و خالص سازی اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود، زیرا هر دو این ژل ها دارای طبیعت متخلخل هستند.

در این فصل ارزیابی حساسیت ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید در تشخیص محصولات PCR مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد. برای این منظور از آمپلیکن های PCR روتاویروس به عنوان مدل استفاده شد. روتاویروس های انسانی به عنوان شایع ترین علت اسهال کم آبی در نوزادان و کودکان خردسال در مقیاس جهانی شناخته شده اند.

مشخصه این ویروس ها وجود 11 بخش RNA دو رشته ای است که توسط سه پوسته مجزا، هسته، کپسید داخلی و کپسید بیرونی احاطه شده است. در حال حاضر، روتاویروس‌ها با توجه به تفاوت‌های آنتی‌ژن‌های خنثی‌سازی VP7 و VP4 که کپسید بیرونی ویریون را تشکیل می‌دهند، به دو ژنوتیپ G و P تقسیم‌بندی می‌شوند. دو واکسن روتاویروس در سال 2006 در بسیاری از کشورها مجوز گرفته است. اگرچه مطالعات ایمنی و اثربخشی در مقیاس بزرگ هر دو واکسن روتاویروس کارایی عالی را در برابر گاستروانتریت شدید روتاویروس نشان داده‌اند (Ruiz-Palacios et al., 2006; Matson, 2006)، فقدان داده‌های واضح در مورد محافظت در برابر ژنوتیپ‌هایی که در واکسن گنجانده نشده است. فرمول‌بندی‌ها بر اهمیت نظارت ویروس‌شناسی، شناسایی سویه روتاویروس و ارزیابی تأثیر این واکسن‌ها در کاهش بیماری اسهال در منطقه ما تأکید می‌کنند (Gentsch et al., 2005; Perez-Schael et al., 1990; Velazquez et al., 1996). علاوه بر این، حضور چندین ژنوتیپ G و/یا P در نمونه‌های منفرد ممکن است یک محیط منحصر به فرد برای اکتساب عفونت مختلط و در نتیجه برای

ژل الکتروفورز اصول و مبانی دسته بندی مجدد ژن های روتاویروس.

این می تواند بر تکامل روتاویروس و عملکرد اثربخشی واکسن های فعلی و آینده تأثیر بگذارد. در این زمینه، آگاهی از ژنوتیپ‌های روتاویروسی که در یک جامعه در گردش هستند و بروز عفونت‌های مختلط روتاویروس برای به دست آوردن درک عمیق از اکولوژی و توزیع سویه‌های روتاویروس و پیش‌بینی تغییرات آنتی ژنی که می‌تواند بر اثربخشی واکسن تأثیر بگذارد، ضروری است. برای این منظور، ژنوتیپ‌های روتاویروس G و P با استخراج RNA ویروسی از نمونه‌های مدفوع و سپس آنالیز توسط PCR ترانس کریپتاز معکوس نیمه تو در تو (RT-PCR) با پرایمرهای خاص برای مناطقی از ژن‌های کدکننده VP7 یا VP4 تعیین می‌شوند. سپس محصولات PCR اختصاصی ژنوتیپ بر روی ژل آگارز یا پلی آکریل آمید و سپس رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید یا رنگ آمیزی نقره به ترتیب تجزیه و تحلیل می شوند.

ماتریس مورد استفاده برای الکتروفورز باید دارای اندازه منافذ قابل تنظیم اما منظم باشد

و از نظر شیمیایی بی اثر باشد و انتخاب اینکه کدام ماتریس ژل استفاده شود در درجه اول به اندازه قطعات جدا شده بستگی دارد (Guilliatt, 2002). همانطور که قبلاً توضیح داده شد، اگرچه اهمیت ویژگی و حساسیت PCR به خوبی شناخته شده است، مکانیسمی که توسط آن نتایج اندازه گیری می شود به همان اندازه مهم است (Wildt et al., 2008). 2. مشخصات کلی ماتریس های آگارز و پلی آکریل آمید 2.1 الکتروفورز ژل آگارز (AGE) آگارز یک پلیمر خطی طبیعی است که از جلبک دریایی استخراج می شود که وقتی در بافر حرارت داده می شود و اجازه می دهد سرد شود، با پیوند هیدروژنی یک ماتریکس ژل را تشکیل می دهد. برای اکثر کاربردها، تنها به یک آگارز تک جزئی نیاز است و نیازی به کاتالیزور پلیمریزاسیون نیست.

بنابراین، ژل آگارز ساده و سریع آماده می شود (چاولا، 2004).

آنها محبوب ترین محیط برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک متوسط ​​و بزرگ هستند و دارای طیف گسترده ای از جداسازی هستند اما قدرت تفکیک نسبتاً کمی دارند، زیرا نوارهای تشکیل شده در ژل ها تمایل به فازی دارند و از هم جدا می شوند. این نتیجه اندازه منافذ است و تا حد زیادی نمی توان آن را کنترل کرد. این مزایا و معایب دیگر استفاده از ژل آگارز برای الکتروفورز DNA در جدول 1 خلاصه شده است (Stellwagen, 1998). مزایا ژل های غیرسمی ژل ها سریع و آسان ریخته می شوند خوب برای جداسازی مولکول های DNA بزرگ می توانند نمونه ها را با ذوب ژل، هضم با آنزیم آگارز یا تیمار با نمک های آشفته بازیابی کنند معایب هزینه بالای نوارهای فازی آگارز جداسازی ضعیف نمونه های با وزن مولکولی کم جدول 1 مزایا و معایب الکتروفورز ژل آگارز.

2.2 الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE)

ژل های پلی آکریل آمید ژل های شیمیایی دارای پیوند متقابل هستند که از پلیمریزاسیون آکریل آمید با یک عامل اتصال عرضی، معمولاً N,N-متیلن بی ساکریل آمید تشکیل می شوند. این واکنش یک پلیمریزاسیون رادیکال آزاد است که معمولاً با پرسولفات آمونیوم به عنوان آغازگر و N,N,N,N-tetramethylethylenediamin (TEMED) به عنوان کاتالیزور انجام می شود. اگرچه ژل‌ها معمولاً سخت‌تر از ژل‌های آگارز آماده می‌شوند، اما نسبت به ژل‌های آگارز زمان بیشتری برای آماده‌سازی دارند، اما مزایای عمده‌ای نسبت به ژل‌های آگارز دارند. آنها یک

مقدمه ای بر ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید با توجه به حساسیت های تشخیص آنها 5 قدرت تفکیک بیشتر، می تواند مقادیر بیشتری از DNA را بدون کاهش قابل توجهی در تفکیک پذیری در خود جای دهد و DNA بازیافت شده از ژل های پلی آکریل آمید بسیار خالص است (Guilliatt, 2002). علاوه بر این، اندازه منافذ ژل های پلی آکریل آمید را می توان به روشی آسان و قابل کنترل با تغییر غلظت دو مونومر تغییر داد. به هر حال، باید توجه داشت که پلی آکریل آمید یک نوروتوکسین است (زمانی که پلیمریزه نشده باشد)، اما با مراقبت های آزمایشگاهی مناسب، خطرناک تر از مواد شیمیایی مختلف رایج نیست (Budowle & Allen, 1991). برخی از مزایا و معایب استفاده از ژل پلی آکریل آمید برای الکتروفورز DNA در جدول 2 نشان داده شده است (Stellwagen, 1998). مزایا ژل با پیوندهای متقاطع شیمیایی پایدار نوارهای تیز برای جداسازی قطعات با وزن مولکولی کم مناسب است ژل با پیوند متقابل شیمیایی پایدار معایب مونومرهای سمی ژل ها برای آماده سازی خسته کننده هستند و اغلب نشت می کنند نیاز به ژل جدید برای هر آزمایش جدول 2. مزایا و معایب الکتروفورزیس ژل پلی آکریل آمید .

سیستم های بافر الکتروفورتیک جداسازی موثر اسیدهای نوکلئیک توسط الکتروفورز ژل آگارز یا پلی آکریل آمید به حفظ موثر ph در ماتریکس بستگی دارد.

بنابراین، بافرها بخشی جدایی ناپذیر از هر روش الکتروفورز هستند. علاوه بر این، تحرک الکتروفورتیک DNA تحت تأثیر ترکیب و قدرت یونی (محتوای نمک) بافر الکتروفورز است (Somma & Querci, 2006). بدون نمک، رسانایی الکتریکی حداقل است و DNA به سختی حرکت می کند. در یک بافر با قدرت یونی بالا، هدایت الکتریکی بسیار کارآمد است و مقدار قابل توجهی گرما تولید می شود. دسته های مختلفی از سیستم های بافر برای الکتروفورز در دسترس هستند: تفکیک کننده و غیر تفکیک کننده، پیوسته و ناپیوسته. 4.1 سیستم های بافر تفکیک کننده و غیر تفکیک شونده تجزیه و تحلیل الکتروفورتیک اسیدهای نوکلئیک تک رشته ای توسط ساختارهای ثانویه فرض شده توسط این مولکول ها پیچیده است. جداسازی بر اساس وزن مولکولی مستلزم گنجاندن عوامل دناتوره‌کننده است که رشته‌های DNA یا RNA را باز می‌کنند و تأثیر شکل را بر تحرک آنها حذف می‌کنند. اسیدهای نوکلئیک ساختارهایی را تشکیل می دهند که توسط پیوندهای هیدروژنی بین بازها تثبیت شده اند. دناتوره شدن مستلزم برهم زدن این پیوندهای هیدروژنی است. بیشترین

مقدمه‌ای بر ماتریس‌های الکتروفورز ژل آگارز و پلی‌اکریلامید با توجه به حساسیت‌های تشخیصی آن‌ها. DNA دناتوره شده با سرعتی از طریق این ژل ها مهاجرت می کند که تقریباً به طور کامل به ترکیب و توالی پایه آن بستگی دارد. سیستم های بافر دناتوره یا تفکیک کننده برای پروتئین ها شامل استفاده از سدیم دودسیل سولفات (SDS) است. در سیستم SDS-PAGE که توسط Laemmli (1970) توسعه یافت، پروتئین ها قبل از الکتروفورز با SDS گرم می شوند تا چگالی بار همه پروتئین ها تقریباً برابر شود. حرارت دادن در SDS، یک ماده شوینده آنیونی، پروتئین‌های موجود در نمونه‌ها را دناتوره می‌کند و محکم به مولکول بدون پیچ (با بار منفی خالص) متصل می‌شود. در نتیجه، هنگامی که این نمونه‌ها الکتروفورز می‌شوند، پروتئین‌ها تنها بر اساس جرم جدا می‌شوند، با تأثیر بسیار کمی از تفاوت‌های ترکیبی. مولکول های DNA دارای بار منفی هستند. بنابراین افزودن SDS در آماده سازی ژل تنها با هدف افزایش قدرت تفکیک باندها است (Day & Humphries, 1994). در غیاب دناتورانت‌کننده‌ها، DNA دو رشته‌ای (dsdna)، مانند یک محصول PCR، ساختار مارپیچی دوتایی خود را حفظ می‌کند، که به آن شکل میله‌ای می‌دهد که از طریق ژل مهاجرت می‌کند.

در طول الکتروفورز مولکول‌های بومی در یک سیستم بافر غیر تفکیک‌کننده، جداسازی با سرعتی تقریباً معکوس با log 10 اندازه آنها انجام می‌شود. 4.2 سیستم های بافر پیوسته و ناپیوسته در سیستم های بافر پیوسته هویت و غلظت اجزای بافر در ژل و مخزن یکسان است. اگرچه سیستم‌های بافر پیوسته به راحتی آماده می‌شوند و وضوح کافی برای برخی کاربردها ارائه می‌دهند، باندها در این ژل‌ها گسترده‌تر و در نتیجه وضوح ضعیف‌تر هستند. این سیستم‌های بافر برای اکثر اشکال الکتروفورز ژل آگارز DNA، که معمولاً حاوی EDTA (ph 8.0) و Trisacetate (TAE) یا Tris-borate (TBE) با غلظت تقریباً 50mM (ph) هستند، استفاده می‌شوند.

TAE ارزانتر است، اما به اندازه TBE پایدار نیست. علاوه بر این، TAE وضوح بهتری از باندهای DNA را در جداسازی های الکتروفورتیک کوتاه می دهد و اغلب زمانی که جداسازی DNA بعدی مورد نظر باشد، استفاده می شود. TBE برای الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید DNA با وزن مولکولی کوچکتر (MW<2000) و الکتروفورز ژل آگارز از DNA طولانی تر که در آن وضوح بالا ضروری نیست استفاده می شود. سیستم های ناپیوسته (چند فازی) از بافرهای مختلفی برای مخزن و ژل و اغلب دو بافر مختلف در داخل ژل استفاده می کنند.

سیستم های ناپیوسته نمونه ها را قبل از جداسازی در یک منطقه بسیار باریک متمرکز یا روی هم می چینند که منجر به بهبود وضوح و وضوح باند می شود. ژل به ژل انباشته بالایی با درصد آکریل آمید کم و ph کم (6.8) و ژل جداکننده با ph 8.8 و منافذ بسیار کوچکتر (درصد آکریل آمید بیشتر) تقسیم می شود. ژل انباشته از هر گونه DNA با وزن مولکولی بالا موجود در نمونه از مسدود شدن منافذ بالای ژل قبل از ورود DNA با وزن مولکولی پایین جلوگیری می کند. هر دو، ژل های انباشته و جداکننده، تنها حاوی کلرید به عنوان آنیون متحرک هستند، در حالی که بافر مخزن حاوی گلیسین به عنوان آنیون با PH 8.8 است.

مزیت عمده سیستم بافر ناپیوسته نسبت به سیستم بافر پیوسته این است که این سیستم ژل می تواند حجم نمونه های بیشتری را تحمل کند (روبین، 1975). 5. بافر بارگذاری این بافری است که باید به قطعه DNA که الکتروفورز می شود اضافه شود. این بافر حاوی گلیسرول یا ساکارز برای افزایش چگالی محلول های DNA است. در غیر این صورت، نمونه ها در مخزن بافر در حال کار حل می شوند و در جیب ژل فرو نمی روند. ژل

6 8 اصول و مبانی الکتروفورز ژل بافر بارگذاری همچنین حاوی رنگ هایی است که مشاهده نمونه را در حین بارگذاری ژل و الکتروفورز تسهیل می کند، مانند بروموفنول بلو یا زایلن سیانول. از آنجایی که این مولکول ها کوچک هستند، در طول الکتروفورز به سرعت از طریق ژل مهاجرت می کنند، بنابراین پیشرفت الکتروفورز را نشان می دهد (چاولا، 2004). اجزاء و غلظت رنگ بارگذاری 6X معمولاً استفاده می شود: 0.25٪ بروموفنل بلو، 0.25٪ زایلن سیانول FF، 30٪ گلیسرول. یا 0.25٪ بروموفنل آبی، 50 میلی متر EDTA، 0.4٪ ساکارز. 6. ولتاژ/جریان اعمال شده هر چه ولتاژ/جریان بالاتر باشد، DNA سریعتر مهاجرت می کند. اگر ولتاژ بیش از حد بالا باشد، ممکن است نوار نواری، به خصوص برای DNA 12-15 کیلوبایت، ایجاد شود.

علاوه بر این، ولتاژ بالا باعث افزایش شدید دما و جریان بافر در مدت زمان بسیار کوتاه می شود. مقدار زیاد گرما و جریان ایجاد شده در فرآیند منجر به ذوب شدن ژل، خنداندن نوارهای DNA، کاهش وضوح باندهای DNA و انفجار فیوز می شود. بنابراین، به شدت توصیه می شود که از 5-8 V/cm و 75 ma برای ژل های اندازه استاندارد یا 100 ma برای مینی ژل ها بیشتر نشود. از طرف دیگر، هنگامی که ولتاژ خیلی کم است، تحرک DNA کوچک (1 کیلوبایت) کاهش می یابد و به دلیل پراکندگی و انتشار، پهن شدن باند رخ می دهد.

7. تجسم DNA پس از اتمام الکتروفورز، روش های مختلفی وجود دارد که ممکن است برای قابل مشاهده کردن گونه های DNA جدا شده در ژل برای چشم انسان استفاده شود. 7.1 رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید (EBS) محل قرارگیری DNA در ژل آگارز را می توان مستقیماً با رنگ آمیزی با غلظت های پایین رنگ فلورسنت اتیدیوم بروماید زیر نور فرابنفش تعیین کرد. رنگ را می توان در هر دو، مخزن بافر در حال اجرا و ژل، ژل به تنهایی، یا ژل را می توان پس از جداسازی DNA رنگ آمیزی کرد.

برای ثبت دائمی، بیشتر عکس های فوری از ژل ها در یک اتاق تاریک گرفته می شود. توجه به این نکته مهم است که اتیدیوم بروماید یک جهش زا قوی و نسبتاً سمی پس از مواجهه حاد است. بنابراین، بسیار توصیه می شود که با احتیاط زیادی با آن رفتار کنید. 7.2 رنگ آمیزی نقره (SS) رنگ آمیزی نقره یک روش بسیار حساس برای تجسم نوارهای اسید نوکلئیک و پروتئین پس از جداسازی الکتروفورتیک روی ژل های پلی آکریل آمید است. اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها یون‌های نقره را متصل می‌کنند که می‌توان آن‌ها را به دانه‌های فلزی نامحلول تبدیل کرد.

رسوب کافی نقره به صورت نوار قهوه ای تیره روی ژل قابل مشاهده است. همه پروتکل‌های رنگ‌آمیزی نقره از مراحل اولیه یکسانی ساخته شده‌اند که عبارتند از: 1) تثبیت برای خلاص شدن از ترکیبات مزاحم، 2) اشباع نقره با محلول نیترات نقره یا محلول پیچیده نقره-آمونیاک، 2) شستشو و توسعه برای ساخت. تصویر فلز نقره را بالا ببرید و iv) متوقف کنید و بشویید تا توسعه قبل از تشکیل بیش از حد پس زمینه و حذف یون نقره اضافی پایان یابد (Chevallet et al., 2006).

8. هدف از این مطالعه هدف از مطالعه ارائه شده در این فصل، تجزیه و تحلیل تأثیر ماتریس الکتروفورز ژل (آگارز و پلی آکریل آمید) و سیستم رنگ‌آمیزی (اتیدیوم) بود.

مقدمه ای بر ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید با توجه به حساسیت های تشخیص آنها

9 رنگ آمیزی برومید و نقره در تشخیص آمپلیکون های ژنوتیپ روتاویروس G (محصولات dsdna). 9. مواد و روش ها 9.1 مجموعه آمپلیکون ژنوتیپ روتاویروس G مجموعه ای نمونه از 2148 نمونه مدفوع از کودکان زیر 3 سال که در بیمارستان های مختلف دولتی و خصوصی در شهر کوردوبا، آرژانتین، در طول دوره خارج از 2148 مدفوع بستری شده بودند، به دست آمد. در مجموع 590 نمونه (5/27%) از نظر عفونت روتاویروس مثبت بودند و همه آنها ژنوتیپ G بودند که با RT-PCR و سپس heminested-pcr مشخص شد. به طور خلاصه، RNA استخراج شده از نمونه های مدفوع با پرایمرهای عمومی Beg9/End9 به cdna تمام طول ژن VP7 رونویسی معکوس شد. سپس محصول cdna به عنوان الگو برای تقویت PCR VP7 با همان جفت پرایمر Beg9/End9 استفاده شد. محصولات PCR تمام طول VP7 به عنوان الگو در ترکیب با دو کوکتل از پرایمرهای فوروارد مخصوص نوع و پرایمر معکوس عمومی End9 برای ژنوتیپ G استفاده شد (Gouvea et al., 1990).

کوکتل ها به شرح زیر بودند: G1 (abt1)، G2 (act2) و G3 (aet3) در یک مخلوط و G4 (adt4)، G8 (aat8) و G9 (aft9) در مخلوط دوم. آمپلیکون‌های به‌دست‌آمده با روش استاندارد الکتروفورز ژل آگارز و رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید (AGE/EBS) و الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید و رنگ‌آمیزی نقره (PAGE/SS) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. آن آمپلیکون هایی که نتایج ناهماهنگی را نشان دادند به منظور تأیید ویژگی باندهای تجسم شده توالی یابی شدند. شکل 1. الگوریتم ارزیابی تفاوت حساسیت بین ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید در تشخیص اسید نوکلئیک.

اصول و مبانی الکتروفورز ژل الگوریتم انجام شده برای ارزیابی تفاوت حساسیت بین ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید در تشخیص اسید نوکلئیک در شکل آماده سازی، اجرا و رنگ آمیزی ژل های آگارز 2 درصد اندازه های مورد انتظار ژنوتیپ نشان داده شده است.

محصولات خاص PCR 749bp (G1)، 652bp (G2)، 374bp (G3)، 583bp (G4)، 885bp (G8) و 306bp (G9) بودند. بنابراین از غلظت 2% آگارز برای الکتروفورز آمپلیکن های PCR استفاده شد (جدول 5). ژل های آگارز با اتیدیوم بروماید برای تجسم بعدی آمپلیکون های DNA (غلظت نهایی 0.5 ug/ml) تیمار شدند. اتیدیوم بروماید به منظور به حداقل رساندن ضایعات حاوی اتیدیوم بروماید به آماده سازی ژل اضافه شد. حجم مساوی 10 میکرولیتر از محصولات همینستد-pcr و بافر Phyndia (0.02M Tris-HCl ph 7.4، 0.3M NaCl، 0.01MgCl2، 0.1% SDS، 5mM EDTA، 4% ساکارز، 0.04% برومول مخلوط شد. برای مقایسه بعدی اندازه آمپلیکون، همراه با یک نردبان DNA 100 pb روی ژل ها قرار دهید. ژل های آگارز در بافر TBE در حال اجرا (0.09M Tris-Borate، 0.002M EDTA) به مدت 30-60 دقیقه در V الکتروفورز شدند. پس از اجرا، محصولات PCR در transilluminator UV مشاهده شدند. محلول آگارز اتیدیوم بروماید (10 میلی گرم در میلی لیتر) آب دیونیزه جدول 5. دستور تهیه ژل آگارز 2 درصد. مقدار/حجم 2 گرم 5 ul 100 میلی لیتر 9.3 تهیه، اجرا و رنگ آمیزی ژل های پلی آکریل آمید 10% از آنجایی که اندازه آمپلیکون مورد انتظار PCR در محدوده bp است، باید از غلظت ژل پلی آکریل آمید 6% استفاده شود، زیرا این غلظت برای جداسازی محصولات توصیه می شود. بین 80 تا 800bp با این حال، کار با این ژل ها دشوار بود، زیرا آنها بسیار لزج بودند. به همین دلیل، غلظت ژل در ژل جداکننده به 10 درصد افزایش یافت و به جداسازی خوبی از تمام آمپلیکون‌های PCR در ژل‌های با این غلظت دست یافت. حجم مساوی 10 لیتر از محصولات همینست شده-pcr و بافر Phyndia مخلوط شدند و روی ژل های پلی آکریل آمید 10 درصد با ضخامت 1 میلی متر بارگذاری شدند. همراه با محصولات PCR، ژل انباشته ژل جداکننده 100pb محلول محلول حجم محلول حجم آکریل آمید 30% 2.5 میلی لیتر آکریل آمید 30% 400 میکرولیتر بیساکریل آمید 1% 0.95 میلی لیتر بیساکریل آمید 1% 250 میکرولیتر تریس-HCl9. (ph 6.8) 315 میکرولیتر SDS 10% 75 میکرولیتر SDS 10% 25 میکرولیتر آب دیونیزه 3.2 میلی لیتر آب دیونیزه 1.5 میلی لیتر TEMED 5 میکرولیتر TEMED 2.5 میکرولیتر پرسولفات آمونیوم 10% 100 میکرولیتر آمونیوم پرسولفات 10% 100 میکرولیتر حجم 2 میلی لیتر آمونیوم پرسولفات 10. جدول 6. دستور تهیه ژل های جداکننده پلی آکریل آمید 10% و انباشته پلی آکریل آمید 5% با استفاده از سیستم بافر غیرقابل تفکیک و ناپیوسته.

مقدمه ای بر ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید با توجه به حساسیت های تشخیص آنها 11 نردبان DNA نیز در ژل بارگذاری شد.

الکتروفورز در یک سلول BioRad در یک سیستم بافر غیرقابل تفکیک و ناپیوسته (بافر ژل انباشته Tris-HCl 1M ph 6.8 و بافر ژل جداکننده Tris-HCl 3M ph 8.7) انجام شد. هر دو، در محلول های ژل انباشته و جداکننده، 10% SDS به منظور افزایش قدرت تفکیک الکتروفورتیک اضافه شد (Day & Humphries، 1994). الکتروفورز در بافر در حال اجرا ph 8.9 (0.3٪ تریس، 1.44٪ گلیسین، 0.1٪ SDS) در طول 2 ساعت در 60 میلی آمپر انجام شد. دستور پخت ژل پلی آکریل آمید 10 درصد ناپیوسته در جدول 6 نشان داده شده است. روش (1982). این شامل: i) تثبیت قطعات DNA در 10٪ اتانول و 0.5٪ اسید استیک گلاسیال، 2) رنگ آمیزی با محلول نیترات نقره 0.011 مولار، 2) توسعه با 0.75M NaOH و 7.6٪ فرمالدئید، و iv) توقف فرآیند با 5٪ اسید استیک یخچالی زمانی که تصویر مورد نظر ایجاد شده بود. مدت زمان هر مرحله از رنگ آمیزی نقره در جدول 7 نشان داده شده است. مرحله محلول مدت زمان 1 محلول ثابت 30 دقیقه 2 آب دیونیزه شده 2 دقیقه 3 محلول رنگ آمیزی 30 دقیقه 4 آب دیونیزه شده 10 ثانیه 5 محلول توسعه دهنده دقیقه (تا زمانی که نوارها قابل مشاهده باشند) 6 محلول توقف به طور نامحدود جدول 7. مراحل رنگ آمیزی نقره و مدت زمان. پس از رنگ آمیزی نقره، ژل های پلی آکریل آمید خشک و نگهداری شدند. هر ژل پلی آکریل آمید بین دو کاغذ سلفون طبیعی (یکی که روی شیشه چسبیده بود) قرار داده شد و در محلول خشک کن حاوی 69 درصد متانول و 1 درصد گلیسرول غوطه ور شد. ژل ها در دمای اتاق به مدت 24-48 ساعت خشک شدند (Giordano et al., 2008). 10. نتایج 10.1 تشخیص ژنوتیپ روتاویروس G توسط AGE/EBS و PAGE/SS تحت شرایط تجربی توصیف شده، تجزیه و تحلیل AGE/EBS از 590 نمونه روتاویروس مثبت نشان داد که در مجموع 32 نمونه (5.4%) PCR را نشان ندادند. محصول تقویتی نوع G پس از الکتروفورز ژل. از 558 نمونه ای که آمپلیکون PCR را نشان دادند، 324 (58.1٪) عفونت ژنوتیپ G منفرد و 234 (41.9٪) عفونت ژنوتیپ G مختلط بودند (دو یا چند آمپلیکون در همان نمونه آشکار شد). از سوی دیگر، تجزیه و تحلیل PAGE/SS آمپلیکون‌های PCR نشان داد که تمام نمونه‌های روتاویروس مثبت (590=n) حداقل یک آمپلیکون را نشان دادند. از بین 590 نمونه، 318 (9/53%) منفرد G سیستم در حال توسعه از نوع عفونت روتاویروسی بودند.

عفونت ژنوتیپ اصول و مبانی الکتروفورز ژل و 272 (1/46 درصد) عفونت نوع G مختلط (240 عفونت دوگانه و 32 عفونت سه گانه) بودند.

لازم به ذکر است که مجموع آلودگی‌های سه‌گانه ژنوتیپ G شناسایی‌شده توسط PAGE/SS به‌صورت دو یا تک ژنوتیپ G توسط AGE/EBS ایجاد شده‌اند. نتایج در جدول 8 نشان داده شده است. تعداد نمونه هایی که هر ژنوتیپ G را نشان می دهند در جدول 9 و شکل 2 نشان داده شده است. نتایج به دست آمده نشان داد که سیستم استاندارد AGE/EBS تعداد کمتری از ژنوتیپ ها را نسبت به PAGE/SS نشان داد. تعداد ژنوتیپ ژنوتیپ های شناسایی شده بر اساس AGE/EBS PAGE/SS GGGG G5 2 2 G8 2 3 G مجموع جدول 9. شناسایی محصولات PCR ژنوتیپ های روتاویروس توسط AGE/EBS و PAGE/SS % شناسایی ژنوتیپ G از دست رفته، 7 36،8 33 ,3 30,4 8,5 0,8 0,0 G1 G2 G3 G4 G5 G8 G9 شکل 2. میزان تشخیص ژنوتیپ روتاویروس G توسط AGE/EBS در مقایسه با PAGE/SS از دست رفته است. 11. بحث در مقایسه جانبی ارائه شده در این مطالعه، روش های تشخیص آمپلیکون به طور کلی نشان داد که تعداد بیشتری از ژنوتیپ ها (11.4٪) می تواند توسط PAGE/SS (n=894) نسبت به AGE/EBS شناسایی شود. (n=792). در بسیاری از موارد، محصولات PCR که به صورت نوارهای ضعیف توسط PAGE/SS تجسم می‌شوند و بعداً توسط توالی‌یابی نوکلئوتیدی به‌عنوان ویژگی‌های خاص تأیید می‌شوند، با تکنیک استاندارد (AGE/EBS) از قلم افتاده‌اند. معمولاً ژنوتیپ‌های G1 و G4 معمولی به‌صورت نوارهای قوی و سایر ژنوتیپ‌ها اغلب به‌صورت نوارهای ضعیف آشکار می‌شوند. بنابراین، تمایل AGE/EBS برای شناسایی نرخ کمتری از ژنوتیپ‌های G یکسان بود

مقدمه ای بر ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید با توجه به حساسیت های تشخیص آنها

برای ژنوتیپ های کمتر متداول، یعنی G2، G3، G8 و G9 مشهودتر است. همچنین 32 نمونه روتاویروس مثبت (4/5%) پس از AGE/EBS هیچ گونه آمپلیکن PCR G را نشان ندادند، در عین حال همه آنها پس از PAGE/SS به ژنوتیپ G اختصاص یافتند. علاوه بر این، کاهش در تشخیص ژنوتیپ روتاویروس توسط AGE/EBS نسبت به PAGE/SS نیز در میزان عفونت‌های روتاویروس مختلط تأثیر داشت. بر اساس این مشاهدات، می توان پیشنهاد کرد که اگر سیستم استاندارد در حال توسعه، AGE/EBS، با تکنیک PAGE/SS جایگزین شود، میزان آلودگی ژنوتیپ G مختلط گزارش شده در سراسر جهان ممکن است بالاتر باشد. حضور مکرر ژنوتیپ های متعدد G در نمونه های منفرد ممکن است یک محیط منحصر به فرد برای دسته بندی مجدد ژن های روتاویروس ارائه دهد. این مفهوم نیاز به بهبود روش‌هایی را که امکان آشکارسازی عفونت‌های همزمان روتاویروس را در مطالعات آینده فراهم می‌کند، برجسته می‌کند. این یافته‌ها به منظور افزایش دانش کنونی در مورد تکامل روتاویروس و تعیین تأثیر احتمالی عفونت‌های مختلط بر پوشش روتاویروس-واکسن و کارایی واکسن مورد توجه است. به طور کلی، نتایج به‌دست‌آمده در این مطالعه نشان می‌دهد که روش بکار گرفته شده برای تجسم محصولات PCR می‌تواند یک عنصر ضروری برای توصیف ژنوتیپ‌های روتاویروس در گردش در یک جامعه و میزان آلودگی ژنوتیپ‌های G مخلوط باشد. با توجه به معرفی اخیر واکسن روتاویروس در بسیاری از کشورها، شناسایی صحیح ژنوتیپ های G درگیر در بیماری اسهالی و تطابق ژنوتیپ های G جدا شده با ژنوتیپ های موجود در فرمولاسیون واکسن برای ارزیابی دقیق کارایی واکسن روتاویروس بسیار مهم است. . 12. قدردانی این کار از سوی شورای علم و فناوری دانشگاه ملی کوردوبا، آرژانتین (Grant) حمایت مالی دریافت کرد. 13. مراجع Budowle, B. & Allen, RC الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید ناپیوسته قطعات DNA. روش‌ها در زیست‌شناسی مولکولی: پروتکل‌ها در ژنتیک مولکولی انسان. (CG Mathew, Ed.). Humana Press Inc., Clifton, NJ. چاولا، تکنیک های اساسی HS. مقدمه ای بر بیوتکنولوژی گیاهی. چاپ 2. Science Publishers, Inc. Enfield, NH, USA. Chevallet, M., Luche, S. & Rabilloud, T رنگ آمیزی نقره ای پروتئین ها در ژل های پلی آکریل آمید. نات پروتکل. 1، Day، IN & Humphries، SE الکتروفورز برای ژنوتیپ: الکتروفورز ژل مورب آرایه میکروتیتر روی ژل های افقی پلی آکریل آمید، هیدرولینک یا آگارز. مقعدی بیوشیمی. 222، Gentsch، JR، Laird، AR، Bielfelt، B.، Griffin، DD، Banyai، K.، Ramachandran، M.، Jain، V.، Cunliffe، NA، Nakagomi، O.، Kirkwood، CD، Fischer، TK , Parashar, UD, Bresee, JS, Jiang, B., & Glass, RI تنوع سروتیپ و دسته بندی مجدد بین سویه های روتاویروس انسانی و حیوانی: پیامدهای برنامه های واکسن روتاویروس. ج. عفونی کردن. دیس 192,S146-S159. Giordano، MO، Masachessi، G.، Martinez، LC، Barril، PA، Ferreyra، LJ، Isa، MB & Nates، SV دو مورد از وقوع پیکوبیرناویروس با مشخصات ژنومی بزرگ در

12 14 اصول و مبانی الکتروفورز ژل نوزادان آرژانتینی مبتلا به اسهال در طی یک دوره 26 ساله ( ). ج. عفونی کردن. 56, Glavač, D. & Dean, M Heteroduplex analysis. فن آوری برای تشخیص آسیب DNA و جهش. (GP Pfeifer). Plenum Press، نیویورک، ایالات متحده آمریکا. Gouvea, V., Glass, R., Woods, P., Taniguchi, K., Clark, H., Forrester, B. & Fang, ZY Polymerase, Glass, R., تقویت واکنش زنجیره ای پلیمراز و تایپ اسید نوکلئیک روتاویروس از نمونه های مدفوع. جی. کلین. میکروب. 28، گیلیات، AM آگارز و الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید. روش‌ها در زیست‌شناسی مولکولی: پروتکل‌های تشخیص جهش PCR. (BDM Theophilus & R Rapley, Ed.). Humana Press Inc.، توتووا، نیوجرسی. Hames, BD مقدمه ای بر الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید. الکتروفورز ژل پروتئین ها: یک رویکرد عملی ویرایش 3. (BDM Hames, Ed.). انتشارات دانشگاه آکسفورد. نیویورک، ایالات متحده آمریکا Herring, A., Inglis, N., Ojeh, C., Snodgrass, D., & Menzies, J تشخیص سریع عفونت روتاویروس با تشخیص مستقیم ژل های پلی آکریل آمید نقره رنگ آمیزی شده با اسید نوکلئیک ویروسی. جی. کلین. میکروب. 16، Laemmli، UK برش پروتئین های ساختاری در طول مونتاژ سر باکتریوفاژ T4. Nature (London) 227, Matson, DO واکسن پنج ظرفیتی روتاویروس Rotateq. سمین. اطفال آلوده کردن دیس 17, Perez-Schael, I., Blanco, M., Vilar, M., Garcia, D., White, L., Gonzalez, R., Kapikian, AZ, & Flores, J مطالعات بالینی یک واکسن روتاویروس چهار ظرفیتی در نوزادان ونزوئلا جی. کلین. میکروبیول. 28, Rubin, GM تهیه RNA و ریبوزوم از مخمر. روش ها در زیست شناسی سلولی: سلول های مخمر. (DM Prescott, Ed.). Academic Press, Inc. London, England. Ruiz-Palacios، GM، Pérez-Schael، I.، Velázquez، FR، Abate، H.، Breuer، T.، Clemens، SC، Cheuvart، B.، Espinoza، F.، Gillard، P.، Innis، BL، سروانتس، Y.، Linhares، AC، لوپز، P.، Macías-Parra، M.، Ortega-Barría، E.، Richardson، V.، Rivera-Medina، DM، Rivera، L.، Salinas، B.، Pavía -Ruz، N.، Salmerón، J.، Rüttimann، R.، Tinoco، JC، Rubio، P.، Nuñez، E.، Guerrero، ML، Yarzábal، JP، Damaso، S.، Tornieporth، N.، Sáez- Llorens، X.، Vergara، RF، Vesikari، T.، Bouckenooghe، A.، Clemens، R.، De Vos، B.، O’Ryan، M.، و گروه مطالعه واکسن روتاویروس انسانی ایمنی و اثربخشی یک واکسن ضعیف شده در برابر گاستروانتریت شدید روتاویروس. N. Engl. جی. مد. 354، اسمیت، الکتروفورز ژل آگارز DR. روش‌ها در زیست‌شناسی مولکولی: تکنیک‌های تراریخت. (D Murphy & DA Carter, Ed.). Humana Press Inc.، توتووا، نیوجرسی. Somma, M. & Querci, M Agarose ژل الکتروفورز (جلسه 5). تجزیه و تحلیل نمونه های غذا برای حضور ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی. (M Querci, M Jermini & G Van den Eede, Ed.). کمیسیون اروپا DG-JRC. الکتروفورز ژل Stellwagen، NC DNA. راهنمای آزمایشگاه الکتروفورز اسید نوکلئیک. (D Tietz, Ed.). Springer Verlag. برلین-هایدلبرگ-نیویورک. Velázquez, FR, Matson, DO, Calva, JJ, Guerrero, L., Morrow, AL, Carter-Campbell, S., Glass, RI, Estes, MK, Pickering, LK, & Ruiz-Palacios, GM Rotavirus عفونت در نوزادان به عنوان محافظت در برابر عفونت های بعدی N. Engl. جی. مد. 335، Wildt، SJ، Brooks، AI، & Russell، RJ ژنتیک، مدل‌ها و روش‌های ژنوتیپ جوندگان. کتاب منبع مدل های تحقیقات زیست پزشکی. (PM Conn, Ed.). مطبوعات هومانا. توتووا، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا

13 الکتروفورز ژل – اصول و مبانی ویرایش شده توسط دکتر سامه مگدلدین شابک جلد سخت، 346 صفحه ناشر InTech منتشر شده آنلاین 04، آوریل، 2012 منتشر شده در نسخه چاپی آوریل، 2012 اکثر موافق هستند که الکتروفورز ژل یکی از پایه های پایه مولکولار مولکولی است. . این اصطلاح ابداع شده، تعداد بی شماری از رویکردهای جداسازی مبتنی بر ژل را پوشش می دهد که عمدتاً بر اساس تکه تکه شدن مولکول های زیستی تحت جریان الکتروفورتیک عمدتاً بر اساس وزن مولکولی است. در این کتاب، نویسندگان سعی می‌کنند اصول ساده‌سازی جداسازی مبتنی بر ژل را همراه با کاربردهای مثال زدنی این تکنیک همه کاره ارائه دهند. ما سعی می کنیم مطالب کتاب را واضح و جامع نگه داریم و امیدواریم که مورد توجه و توجه خوانندگان قرار گیرد. نحوه ارجاع برای ارجاع صحیح به این اثر علمی، در صورت تمایل موارد زیر را کپی و جایگذاری کنید: پاتریشیا باریل و سیلویا نیتز (2012). مقدمه ای بر ماتریس های الکتروفورز ژل آگارز و پلی آکریل آمید با توجه به حساسیت های تشخیص آنها، الکتروفورز ژل – اصول و مبانی، دکتر سامه ماگدلدین (ویرایش)، ISBN:، InTech، موجود در: پردیس دانشگاه InTech اروپا STeP Riverka Slavka KrautA Rijeka، کرواسی تلفن: +385 (51) فکس: +385 (51) InTech China Unit 405, Office Block, Hotel Equatorial Shanghai No.65, Yan An Road (West), Shanghai, , China تلفن: فکس: