Poliacrilammide

Applicazione della poliacrilammide (PAM)

• Strato di rivestimento in carta
• Linea di produzione di idrogel
• Coagulanti nel trattamento delle acque e delle acque reflue
• Agente precipitante in vari settori come l’industria della canna da zucchero, la pulizia attiva dei fiori, la pulizia di alimenti e bevande.
• Fattore che controlla l’energia cinetica durante l’allagamento
• Additivo per migliorare la fluidità dell’olio nei pozzi petroliferi.
• Aiuta nella fratturazione idraulica, nell’acidificazione e in altre operazioni minerarie.
• Maggiore forza
• Rivestimento di materiali diversi da carta e tessuti
• Utilizzo in edilizia e sviluppo urbano per il consolidamento del terreno
• Applicazione nella preparazione di adesivi
• Ridurre l’erosione e migliorare le proprietà fisiche del suolo
• Materie plastiche e additivi
• Industria mineraria per la raffinazione di alcuni metalli come l’alluminio.

Chimica e fotodegradazione della poliacrilammide utilizzata nella purificazione dell’acqua potabile

Chimica e fotodegradazione della poliacrilammide utilizzata nel trattamento dell’acqua potabile, Piao Cheng University, Florida meridionale. Segui questo e altri lavori: parte degli studi statunitensi. , “Degradazione chimica e fotolitica delle poliacrilammidi utilizzate nella purificazione dell’acqua potabile” (2004). Discussione di tesi e dissertazioni. La Commons Graduate School of Fellowship ti offre questa tesi gratuitamente. Dissertazioni e tesi sono state accettate per l’inclusione da un amministratore Scholar Commons approvato. Per maggiori informazioni contattare

Chimica e fotodegradazione della poliacrilammide utilizzata nella purificazione dell’acqua potabile

Di Peiyao Cheng Una tesi presentata a parziale soddisfazione dei requisiti per il diploma di Master of Science presso il Dipartimento di Scienze e Politiche Ambientali, College of Arts and Sciences, University of South Florida. Istruttore senior: Audrey D. Levine, Ph.D. Donald Duke, Ph.D. Dottor Abdul Malik. Data di approvazione: 12 novembre 2004 Parole chiave: polielettrolita, monomero di acrilammide, ossidazione, irradiazione ultravioletta, flocculazione. Copyright 2004, Piiyao Cheng.

4.2.1 Sinterizzazione del polimero mediante ossidazione del cloro Ossidazione del polimero mediante ossidazione del permanganato

32 Risultati e discussione della distruzione chimica dei residui UV ossidati/assorbimento di tutti i residui di carbonio organico. Residui anomali di azoto acrilammide 6. Riferimenti 62 Appendice 67 Appendice A: Test dei solidi totali 68 Appendice B: Test del cloro 70 Appendice C: Test del permanganato 71 Appendice D: Test dell’acrilammide GC-ECD 73 Appendice E: Scheda tecnica sulla sicurezza dei materiali 76 e Appendice F: Schema 89 ii

6 Elenco delle tabelle Tabella 2.1 Percorsi di degradazione della poliacrilammide 8 Tabella 2.2 Degradazione della poliacrilammide mediante cloro o ozono 11 Tabella 2.3 Fattori che influenzano l’efficienza della sinterizzazione dei polimeri Test sull’azoto 28 Tabella 3.4 Test sui residui di acrilammide 29 Tabella 4.1 Tabella 4.2 Tabella 4.3 Confronto del cloro // Riduzione residuo di permanganato dopo la reazione con tre campioni PAM (N-3300 P e A-3333 P e C-3328 per C-435 h) Contenuto di azoto di tre Clarifloc PAM (N 3300 P, A-3333 P e C-3280) prima e dopo KMnO 4 (4 mg/l e 6 mg/l) e ossidazione con cloro (10 mg/l e 15 mg/l) entro 48 ore. Confronto prima e dopo dell’efficienza di flocculazione dei PAM di poliacrilammide (PAM). Ossidazione con cloro libero (10 mg/l) o permanganato di potassio (4 mg/l) 55 ter

7 Elenco delle figure Figura 1.1 Struttura della poliacrilammide. (a) PAM non ionico; (b) Polimero anionico PAM. (c) Copolimero cationico di ACM e DADMAC 2 Figura 2.1 Struttura dell’acrilammide 6 Figura 2.2 Reidrolisi acida della poliacrilammide 9 Figura 2.3 Idrolisi alcalina della poliacrilammide 9 Figura 3.1 Diagramma schematico dell’acrilammide dopo l’ossidazione Figura 21. 10 mg/l Clarifloc C-3280 ( Dose di KMnO 4 Cloro ad una concentrazione di 15 mg/l) 36 Figura 4.4 Spettro UV di Clarifloc N-3300 P (10 mg/l) L) 38 Figura 4.5 Spettro UV di Clarifloc A-3333P (10 mg/l) 39 Figura 4.6 Spettro UV di Clarifloc C-3280 (10 mg/l) 39 Figura 4.7 Figura 4.8 Figura 4.9 Cambiamenti nell’assorbimento UV viola a 195 nm (misurato) su campioni PAM da 5 cm). 10 mg/L) cambia in seguito all’esposizione a 2 mg/L di KMnO4 40. Assorbimento UV a 195 nm (misurato in una cella da 5 cm) per campioni PAM (10 mg/L). m) Se esposto a 5 mg/l di cloro libero.

8 Figura 4.10 Figura 4.11 Figura 4.12 Spettro UV di Clarifloc C-3280 (10 mg/L) dopo l’aggiunta di 5 mg/L di cloro per 30 minuti. , A-3333P e S-3280) dopo 5 ore di ossidazione 44 Effetto del dosaggio di KMnO4 sul contenuto di carbonio ossidato di tre PAM (N 3300P, A-3333P e S-3280) dopo 5 ore di ossidazione 44 Figura 4.13 Acrilammide residua a 10 mg/l C -3280 (ponderato con standard di acrilammide 10 µg/L) 45 Figura 4.14 Acrilammide residuo a 10 mg/L C-3280 (10 µg/L di acrilammide come standard) dopo esposizione a 15 mg/L di acrilammide per 30 minuti 46 Figura 4.15 Acrilammide residuo a 10 mg/l C – 3280 (Determinato utilizzando lo standard di acrilammide 10 µg/l) dopo esposizione a 6 mg/l. KMnO4 per 30 minuti. 46 Figura 4.16 Figura 4.17. Con assorbanza UV a 195 nm (misurata in una cuvetta da 5 cm) di tre PAM quando esposti a UV 50 Effetto della radiazione UV sul contenuto TOC di tre PAM 50 Confronto dell’acrilammide residua a 10 mg/L C-3280 in condizioni diverse ( Esposizione ai raggi UV, cloro, permanganato e loro combinazioni) 52 Confronto della quantità di cloro consumata durante l’ossidazione di tre PAM (10 mg/l) con solo cloro libero (15 mg/l) La miscela viene esposta alla luce UV per 30 minuti. E in combinazione con UV per 30 minuti 54B.

Figura F-1 Figura F-2 Figura F-3 Figura F-4 Figura F-5 Figura F-6 Figura F-7 Figura F-8 Figura F-9 Figura F-10 Figura F-11 Figura F-12 Riduzione residua permanganato quando interagisce con soluzioni di 10 ppm PAM (KMnO 4 in una dose di 6 ppm) 89 Riduzione dei residui di permanganato quando interagisce con soluzioni di 10 ppm PAM (KMnO 4 in dose 4 ppm) 89 Riduzione del residuo di permanganato dopo reazione ripetuta con 1 ppm (KMnO 4 alla dose di 2 ppm) 90

Riduzione del cloro residuo quando si reagisce con una soluzione PAM di 10 ppm (Cl 2 alla dose di 10 ppm)

90 Riduzione dei residui di cloro durante la reazione con soluzioni PAM con una concentrazione di 10 ppm (Cl 2 ppm alla dose di 95) Consumo di cloro in 30 minuti per tre PAM con e senza effetto UV (dose Cl 2 a 5 ppm) 91 confronto Cloro consumo in 30 minuti per tre PAM con e senza effetto UV (Cl 2 alla dose di 10 ppm) 92 rispetto a consumato KMnO 4 in 30 minuti per tre PAM con e senza effetto UV (KMnO 4 alla dose di 2 ppm) 92 Rischio comparativo per KMnO 4 consumato in 30 minuti per tre PAM con e senza effetto UV (KMnO 4 alla dose di 6 ppm) 93 Cromatogramma dell’acrilammide residua a 10 ppm. C-3280 (standard AC 10 ppm) dopo esposizione ai raggi UV 93 cromatogrammi di acrilammide residua a 10 ppm C-3280 (standard ACM 10 ppm) dopo esposizione ai raggi UV e 6 ppm di KMnO 4 per 30 minuti 94 cromatogrammi di acrilammide residua a 10 ppm (10 ppm con lo standard ACM3) ) dopo esposizione a radiazioni UV e cloro a 15 ppm per 30 minuti e 94 VI.

10 Elenco delle abbreviazioni Adam MeCl AWWA ACM CD CV DADMAC DBP EAD EPA Epi-DMA GC GH LD 50 MS MW MSDS NDMA NOM PAM PATA Py-GC Py-GC-MS SEC TOC UV WHO Etanamina N, NN – (1-oxo – 2 )-propenil) Ossicloruro Acrilammide Cristalvioletto Densità di carica Diallile Sottoprodotti di disinfezione del cloruro di dimetilammonio Reagente di cattura di elettroni EPA Epicloridrina-dimetilammina Gascromatografia-Dimetilammina Scheda dati di sicurezza, poliacrilammide, poliacrilammide, addensante, pirolisi, gascromatografia, pirolisi, gascromatografia, spettrometria di massa, cromatografo ad esclusione dimensionale, Organizzazione mondiale della sanità, sostanze ultraorganiche

Prodotto chimico e fotodegradazione della poliacrilammide utilizzata nella purificazione dell’acqua potabile PEYAO CHENG

Breve descrizione delle poliacrilammidi (PAM)

Esiste un gruppo di polimeri costituiti solo da acrilammide o copolimerizzati con altri monomeri. I PAM sono stati utilizzati nella purificazione dell’acqua potabile come flocculanti o coagulanti nella misura maggiore tra tutti i tipi di polimeri. Nei processi di purificazione dell’acqua potabile, la poliacrilammide è spesso esposta ad agenti ossidanti (come cloro e permanganato) e a radiazioni ultraviolette provenienti dalla luce solare o da fonti artificiali. Lo scopo di questo studio è valutare la potenziale degradazione del PAM causata dall’ossidazione chimica e/o dalle radiazioni UV. Tre tipi di prodotti PAM (non ionici, cationici e anionici) sono stati studiati durante l’ossidazione del cloro libero, del permanganato, delle radiazioni UV e dei loro effetti combinati. Il PAM cationico è risultato il polimero più instabile tra i tre tipi di campioni di polimeri studiati, ma è stata osservata solo una degradazione minore. L’acrilammide residua nel PAM C-3280 positivo ha superato il valore delle linee guida statunitensi e l’esposizione al cloro o al permanganato ha parzialmente ridotto i livelli di acrilammide. I raggi UV non distruggono l’intero polimero

Contenuto e residui di acrilammide

, ma questo ha accelerato la distruzione causata dai prodotti chimici. L’esposizione al cloro o al permanganato per 1 ora ha comportato una riduzione del 20-35% dell’efficienza di flocculazione per ciascun campione di polimero. L’esposizione a breve termine (5 minuti) non ha portato alla perdita delle proprietà di flocculazione dei PAM non ionici e anionici. Tuttavia, per il PAM cationico, anche l’esposizione a breve termine al cloro ha comportato una diminuzione dell’efficienza di flocculazione percentuale, indicando che il PAM cationico è più suscettibile all’ossidazione. Nono

Introduzione ai polimeri organici

Sono stati utilizzati per purificare l’acqua potabile da più di 40 anni. Nel 1967, il Servizio Sanitario Pubblico degli Stati Uniti approvò il primo polimero organico completamente sintetico per il trattamento dell’acqua potabile (AWWA, 2001). 15 anni dopo, è stato stimato che più della metà degli impianti di trattamento dell’acqua negli Stati Uniti utilizzavano uno o più polimeri per migliorare l’efficienza di filtrazione (AWWA Coagulation and Filtration Committee, 1982). Sebbene l’EPA accetti migliaia di prodotti polimerici, si ritiene che il numero di composti associati a questi prodotti sia inferiore a 20, con i prodotti in poliacrilammide che rappresentano la porzione maggiore (Hanson et al., 1983; Mangravite, 1983). ). Le poliacrilammidi (PAM) sono una famiglia di polimeri e copolimeri che variano in termini di forma del prodotto, tipo di carica, densità di carica, peso molecolare e altre proprietà. Sono tipicamente polimerizzati mediante acrilammide (ACM) da sola per formare un polimero non ionico, mediante acido acrilico o sali di acido acrilico per formare un polimero anionico o mediante un monomero cationico (come DADMAC) per formare un polimero cationico. I PAM anionici possono anche essere preparati mediante idrolisi alcalina di PAM non ionici. La struttura del PAM e di alcuni copolimeri è mostrata nella Figura 1.1 (adattata da Bolto, 1995). 1

Struttura in poliacrilammide.

(a) PAM non ionico; (b) Polimero anionico PAM. (c) Copolimero cationico di ACM e DADMAC (adattato da Bolto, 1995). I PAM sono stati utilizzati in varie applicazioni come la coagulazione/flocculazione dell’acqua potabile e delle acque reflue, il condizionamento del suolo, l’agricoltura, l’estrazione del petrolio e le applicazioni biomediche. Questa tesi si concentra sulla sua applicazione nel trattamento dell’acqua potabile. Nel trattamento dell’acqua potabile, i PAM vengono generalmente aggiunti durante la coagulazione o la flocculazione per destabilizzare il particolato e la materia organica naturale (NOM) e facilitarne la rimozione mediante sedimentazione o filtrazione. I PAM cationici sono spesso utilizzati come coagulanti primari per migliorare la coagulazione e la sedimentazione (o filtrazione) di particelle caricate negativamente nelle acque naturali attraverso 2.

Assorbimento e neutralizzazione della carica superficiale

(Letterman e Perot, 1990). I PAM non ionici e anionici hanno tipicamente un peso molecolare più elevato (o una lunghezza della catena più lunga) rispetto ai PAM cationici. Vengono spesso aggiunti dopo la coagulazione per aiutare a collegare le molecole caricate positivamente per formare agglomerati più grandi attraverso un meccanismo chiamato ponte polimerico. Nella purificazione dell’acqua potabile, oltre agli elettroliti organici, vengono utilizzati anche diversi prodotti chimici, tra cui agenti ossidanti (come cloro, ozono, permanganato e biossido di cloro), calce, coagulanti metallici, fluoruro e inibitori della corrosione. Nel trattamento delle acque superficiali, gli agenti ossidanti vengono spesso aggiunti prima della coagulazione (detta preossidazione) per ridurre i metalli e i composti associati al gusto e all’odore (Levine et al., 2004). Si teme che gli ossidanti rimanenti possano reagire con i polielettroliti organici aggiunti per la coagulazione/flocculazione e che queste reazioni possano influenzare negativamente le prestazioni dei polimeri e portare alla formazione di precursori del sottoprodotto della disinfezione (DBP) (Levine et al., 2004 ). . Nella maggior parte dei casi, dopo la purificazione dell’acqua vengono aggiunti agenti ossidanti per disinfettarla. L’ossidante residuo viene solitamente trattenuto nell’acqua finita per controllare la crescita batterica nei sistemi di distribuzione. Quando nell’acqua di alimentazione sono presenti polimeri residui, possono verificarsi reazioni con ossidanti residui che possono portare alla formazione di alcune sostanze tossiche (ad esempio monomero di acrilammide) o sottoprodotti di disinfezione. 3

Lo scopo di questo studio era di valutare i cambiamenti nei monomeri di poliacrilammide e acrilammide durante il trattamento dell’acqua.

I risultati di questo studio potrebbero fornire prove scientifiche che potrebbero essere utili per valutare l’efficacia delle attuali politiche relative all’uso della poliacrilammide. Gli obiettivi specifici di questo studio sono: 1) Valutare la degradazione chimica della poliacrilammide causata da cloro e permanganato in base alla riduzione degli ossidanti residui e ai possibili cambiamenti nella poliacrilammide (carbonio organico totale, spettro UV/assorbanza) e nelle sue impurità (acrilammide) . resto). e azoto inorganico residuo); 2) Fotodegradazione della poliacrilammide sotto l’influenza della luce solare artificiale con uno spettro UV, basata sulla variazione del carbonio organico totale, dell’assorbimento UV e dei residui di acrilammide, nonché per valutare l’effetto della radiazione UV sull’ossidazione dei PAM di cloro/permanganato. 3) Valutazione dell’influenza degli agenti ossidanti (cloro e permanganato) sull’efficienza della flocculazione delle poliacrilammidi, in base alla velocità di sedimentazione della sospensione di caolino. 4) Fornire proposte per la selezione e l’utilizzo di polimeri nella purificazione dell’acqua potabile. 4

Background Questo capitolo discute le proprietà dell’acrilammide e dei suoi polimeri.

Questo capitolo fornisce una revisione di studi precedenti sulla degradazione fotolitica e chimica dei polimeri, sui cambiamenti nelle caratteristiche associate alla degradazione dei polimeri e sull’analisi chimica dei monomeri di poliacrilammide (PAM) e dell’acrilammide (ACM). Nella sezione finale vengono trattate le normative attuali relative ai prodotti PAM. 1. Acrilammide e poliacrilammide L’acrilammide è il monomero principale della poliacrilammide. Tuttavia, l’acrilammide e la poliacrilammide hanno proprietà completamente diverse. Questa sezione presenta le proprietà fisiche, chimiche e biologiche dell’acrilammide e della poliacrilammide, che sono molto importanti per comprendere la degradazione della poliacrilammide e dei suoi monomeri. 1.1 Acrilammide L’acrilammide è una sostanza bianca, inodore, cristallina, solubile in acqua e in altri solventi polari come acetone e acetonitrile. Contiene due gruppi funzionali principali: un gruppo ammidico e un doppio legame carbonio-carbonio (Figura 2.1) (Caufield et al., 2002). A causa del doppio legame carente di elettroni, l’acrilammide è suscettibile a un’ampia gamma di reazioni come addizione nucleofila, reazioni di Diels-Alder e reazioni radicaliche (MacWilliams, 1973). CH 2 CH CO NH 2 Figura 2.1 Struttura dell’acrilammide (adattato da Caufield et al., 2002) L’acrilammide può essere altamente tossica.

Viene facilmente assorbito per ingestione transdermica e inalazione e quindi ampiamente distribuito nei fluidi corporei.

(Organizzazione Mondiale della Sanità, 1996). La LD50 orale (dose letale per metà della popolazione) è mg/kg di peso corporeo per i ratti e mg/kg di peso corporeo per i ratti (Leiterman e Biro, 1990). La LD50 per la somministrazione transdermica nei ratti è di 400 mg/kg di peso corporeo (OMS, 1996). L’acrilammide è anche una neurotossina cumulativa che può causare danni ai nervi attraverso l’esposizione orale cronica negli esseri umani e negli animali, causando effetti come intorpidimento e debolezza delle braccia e delle gambe (US EPA, 1999). I rischi di cancro sono stati documentati anche in studi sia sugli esseri umani che sui topi. Pertanto, la US Environmental Protection Agency (EPA) ha classificato l’acrilammide come sostanza B2, un probabile cancerogeno per l’uomo (US EPA, 1984 e 1993). 1.2 Poliacrilammide La poliacrilammide viene preparata mediante polimerizzazione radiale libera dell’acrilammide utilizzando vari sistemi di iniziazione (come perossidi, perossidi, coppie redox e fotochimiche) in soluzioni o dispersioni acquose.

Le proprietà fisiche di ciascun prodotto di poliacrilammide sono generalmente diverse.

Ad esempio, la forma del PAM può essere solida, emulsionata o disciolta, con un peso molecolare compreso tra migliaia e oltre milioni di dalton. La poliacrilammide è relativamente non tossica per gli esseri umani, gli animali, i pesci e le piante (Seybold, 1994; Organizzazione Mondiale della Sanità, 1985). La LD50 orale per i ratti è superiore a 5.000 mg/kg di peso corporeo e per i pesci superiore a 100 mg/kg (Scheda dati di sicurezza del materiale nell’Appendice E). Mentre l’acrilammide reagisce senza un elettrone a causa del doppio legame, la poliacrilammide è relativamente inerte a causa della mancanza di un doppio legame, che viene rimosso durante la polimerizzazione (MacWilliams, 1973). Tuttavia la poliacrilammide è soggetta a diversi processi di degradazione a seconda della natura del polimero, delle impurità presenti e delle condizioni a cui è esposta. Ad esempio, il gruppo ammidico nella poliacrilammide può subire idrolisi e disidratazione (Caulfield et al., 2002). In generale, le reazioni di decomposizione sono irreversibili e modificano le proprietà fisiche e chimiche del polimero. Anche i sottoprodotti della decomposizione sono motivo di preoccupazione perché possono contribuire alla tossicità rilasciando monomeri di acrilammide o formando sottoprodotti disinfettanti (ad esempio trialometano) a seguito della clorazione. 2. Degradazione del poliacrilammide Esistono cinque modi principali di decomposizione del poliacrilammide: decomposizione termica, fotodecomposizione, biologica, chimica e meccanica.

Il meccanismo di questi percorsi di degradazione è stato studiato da Caulfield et al.

(2002) e sono riassunti nella Tabella 2.1. La chimica e la fotodegradazione sono al centro di questa tesi e vengono discusse qui. Tabella 2.1 Vie di degradazione della poliacrilammide (Caufield et al., 2002). C fino a 300 °C: reazione irreversibile del gruppo funzionale ammidico, aggiunta di O 2 mediante irradiazione UV (fotoossidazione), idrolisi di basi con elevata forza di taglio, sollecitazione meccanica diretta, agitazione) > 300 °C: decomposizione chimica di sostanze libere ammide, fissione della catena Scissione casuale del legame radicale basico (cioè H 2 O 2, K 2 S 2 O 8) 2.1 Degradazione chimica di molte acrilamidi Quando si tratta l’acqua con poliacrilammide (PAM), vari prodotti chimici, inclusi agenti ossidanti (come cloro, cloramina e ozono), possono essere utilizzati in parallelo ai polielettroliti. permanganato, perossido), coagulanti (come allume, solfato ferroso), prodotti chimici per la regolazione del pH (come calce, soda caustica, carbonato di sodio, acido solforico), fluoruri e inibitori della corrosione. Queste sostanze chimiche, soprattutto gli agenti ossidanti, possono reagire con i residui di polielettroliti presenti nell’acqua e ciò porta alla loro distruzione. Il pH 8 influenza anche la velocità e l’entità della degradazione del polimero (Soponkanaporn e Gehr, 1989). In condizioni acide o basiche, le poliacrilammidi sono suscettibili all’idrolisi.

Reazione di idrolisi acida

Implica l’aggiunta di acqua ad un’ammide nucleofila protonata seguita dalla rimozione di NH 3 . Per formare la porzione di acido acrilico, un protone viene quindi rimosso mediante NH 2 – dalla porzione di acido acrilico per formare l’anione carbossilico e l’ammoniaca più stabili (Caulfield). et al., 2002). Si ritiene che durante l’idrolisi acida o basica cambi solo il gruppo ammidico del PAM e non si osservi alcuna perdita di peso molecolare. Figura 2.2 Idrolisi acida della poliacrilammide (adattato da Caulfield et al., 2002) Figura 2.3 Idrolisi alcalina della poliacrilammide (adattato da Caulfield et al., 2002) 9

22 La degradazione della poliacrilammide causata dal cloro e dall’ozono è stata ampiamente studiata. Un confronto dei risultati dello studio è presentato nella Tabella 2.2. Soponkanaporn e Ger (1987) hanno utilizzato la cromatografia ad esclusione dimensionale per studiare la degradazione della poliacrilammide cationica da parte dell’ozono. È stato riportato che il peso molecolare dei polimeri diminuisce da circa 6 milioni a meno di 1 milione dopo l’esposizione all’ozono per 10 minuti. La degradazione del PAM cationico (1–100 mg/L) è stata studiata sotto l’influenza sia del cloro (20 mg/L) che dell’ozono (3 mg/L) a livelli di pH compresi tra 3 e 9 (Gehr e Soponkanaporn, 1990 ). ). In tutti gli esperimenti è stata utilizzata acqua bidistillata. L’ossidazione della poliacrilammide (PAM), del cloro e dell’ozono ha comportato una diminuzione del peso molecolare del polimero senza una perdita significativa di carbonio organico totale (TOC) e di azoto totale (TN). Questo risultato è stato confermato da Levin et al. (2004), che hanno studiato la degradazione di due poliacrilammidi e hanno scoperto che il cloro aveva l’effetto minimo sul carbonio organico totale. Anche la formazione di sottoprodotti tossici (come acrilammide e cloroformio) durante la degradazione dei polimeri è diventata un ulteriore ma importante problema. Gli studi hanno dimostrato che i monomeri di acrilammide non si formano durante la decomposizione del PAM da parte di cloro e ozono. Infatti, l’ossidazione ha comportato una diminuzione della concentrazione di acrilammide residua (Ger e Soponkanaporn, 1990). Il risultato è coerente con i risultati di Mallevialle et al. 10

Ozono acrilammide

L’acrilammide nel PAM anionico è stata studiata in modo indipendente. I monomeri di acrilammide sono stati rimossi rapidamente, con un coefficiente di velocità di reazione del primo ordine di -0,14/min. La formazione di cloroformio è stata rilevata durante la clorazione e la sua concentrazione aumentava con l’aumentare della concentrazione dell’elettrolita e del tempo di incubazione (Gehr e Soponkanaporn, 1990). Un altro studio sulla formazione di cloroformio dal PAM cationico ha rilevato che la velocità e l’entità della reazione del polimero aumentavano con l’aumento del pH e della temperatura (Gehr e Soponkanaporn, 1989). La N-nitrosodimetilammina (NDMA) è un noto cancerogeno per gli animali con una dose orale letale di 58 mg/kg nei ratti (NDMA Material Safety Data Sheet, 2004). È stato riportato che l’invecchiamento di una soluzione madre di Epi-DMA (epicloridrina-dimetilammina) determina un aumento della produzione di NDMA in un periodo di 5 ore (Kohut e Andrews, 2003). 2.2 Fotodegradazione della poliacrilammide Si ritiene che la fotodegradazione della poliacrilammide sia un processo di radicali liberi che può portare alla scissione della struttura polimerica (separazione della catena), alla reticolazione, all’introduzione di nuovi gruppi funzionali e alla formazione di prodotti ad alto peso molecolare. Reddy et al., 1994; Caulfield et al., 2002). Caulfield et al. (2003) hanno studiato la stabilità della poliacrilammide lineare in condizioni di riscaldamento e radiazione. È stato riscontrato che i PAM sono stabili se esposti a lampade fluorescenti e non emettono quantità apprezzabili di 12

Superficie dell’acrilammide a 95 °C, sebbene la decomposizione idrotermale avvenga mediante idrolisi dei gruppi ammidici della catena laterale in gruppi acidi.

In seguito all’irradiazione UV a 254 nm, sono state rilasciate piccole quantità di acrilammide (tipicamente meno di 50 ppm di unità ripetitive monomeriche nel polimero) ed è stata osservata una diminuzione della viscosità. Si è concluso che il rilascio di acrilammide era dovuto al distacco della catena piuttosto che alla decompressione della catena polimerica. Smith et al (1996, 1997) hanno esaminato la degradazione dell’addensante di poliacrilammide (PATA) formulato senza l’erbicida glifosato (GH) in campioni di acqua distillata deionizzata, acqua di superficie e acqua sotterranea. A temperature di laboratorio controllate (4, 25 e 37 °C), in condizioni di luce (lunghezze d’onda tra 300 e 700 nm) e all’aria aperta, è stato riscontrato che la presenza di GH, acrilammide e/o poliacrilammide protegge dalla degradazione. Rallenta o provoca la decomposizione della poliacrilammide. Per l’acrilammide, hanno proposto che il GH possa agire come un cromoforo assorbendo la radiazione luminosa e trasferendo energia alla poliacrilammide, rompendo così i legami CC nel polimero. Tuttavia, le loro conclusioni sono state contestate da altri ricercatori. Wehrs (1999) ha condotto esperimenti in condizioni di decomposizione simili, ma ha ottenuto risultati diversi da Smith. Viers ha concluso che la poliacrilammide non può essere scomposta in monomeri di acrilammide in presenza di luce solare, dell’erbicida glifosato o di qualsiasi combinazione di questi. Ha menzionato 13 casi

26 Svantaggi dei metodi utilizzati da Smith et al.

Nell’analisi dell’acrilammide, ad esempio, la scarsa risoluzione tra il monomero di acrilammide e l’acido acrilico, queste carenze potrebbero contribuire a risultati errati.

Kay Shoemaker et al. (1998) hanno anche messo in dubbio l’affidabilità delle precedenti conclusioni di Smith et al. (1996 e 1997) riguardo alla capacità della poliacrilammide di degradarsi a monomero. Il loro studio ha dimostrato che l’irradiazione ultravioletta della poliacrilammide anionica ad alto peso molecolare porta ad una diminuzione del peso molecolare del polimero. Tuttavia, non c’erano prove a favore dell’acrilammide perché il PAM trattato con UV non poteva supportare la crescita batterica (il monomero di acrilammide può fungere da unica fonte di carbonio per la crescita batterica). I loro risultati mostrano che l’acrilammide non si forma quando la poliacrilammide viene decomposta dai raggi UV. Anche i risultati di Smith et al. sono stati contestati. (1996 e 1997) altri ricercatori: Bologna et al. (1999) hanno dimostrato che se la polimerizzazione fosse effettivamente avvenuta, la concentrazione di acrilammide osservata sarebbe stata molto più elevata di quanto affermato da Smith et al (1996, 1997). È stato anche suggerito che la ricostruzione del doppio legame nell’acrilammide da PAM sia termodinamicamente impossibile. Pertanto, è generalmente accettato che l’irradiazione UV possa portare ad una diminuzione del peso molecolare della poliacrilammide, ma esiste ancora controversia riguardo alla possibilità di decomposizione della poliacrilammide in monomeri di acrilammide, che dovrebbe essere spiegata in maggiore dettaglio. 14

27 3. Efficienza della flocculazione L’efficienza del flocculante può essere valutata in termini di velocità di sedimentazione della poliacrilammide (PAM), limpidezza, dimensione del fango o portata del flocculante, che sono influenzati dalla complessa interazione di una serie di fattori riepilogati nella Tabella 2.3. Tabella 2.3 Fattori che influenzano l’efficienza della sinterizzazione del polimero (adattato da Owen et al., 2002; Farrow e Swift, 1996) Densità di carica, peso del fiocco, forma funzionale dell’aspetto dinamico della forza di agitazione e durata. Numerosi autori hanno studiato la relazione tra le prestazioni di sinterizzazione e le proprietà fisiche dei polielettroliti, in particolare il peso molecolare e la densità di carica. Per il PAM cationico, la neutralizzazione della carica è stata proposta come meccanismo di sinterizzazione dominante, il che significa che l’aumento della densità di carica del polimero cationico porta a migliori prestazioni di sinterizzazione (Tiravanti et al., 1985; Mabire et al., 1983). Tuttavia, le loro conclusioni sono state contestate da altri ricercatori: Smith-Palmer et al. (1994) hanno studiato l’efficienza di flocculazione di una serie di PAM cationici utilizzando le velocità di sedimentazione del caolino. Aveva 15 anni

Si è scoperto che la velocità di sedimentazione è inversamente proporzionale alla densità di carica, indicando che il ponte può svolgere un ruolo importante nel meccanismo di flocculazione.

Questo risultato fu supportato da Gill e Harrington (1986), i quali conclusero che la densità di carica non era il fattore limitante, ma il bridging era il meccanismo dominante, e che le differenze nei tassi di deposizione dovevano essere dovute a piccole differenze nel peso molecolare. Un altro fattore discusso è l’invecchiamento delle soluzioni PAM (solitamente settimane o mesi). Shiluk e Stowe (1969) osservarono che la diminuzione della viscosità di una soluzione di poliacrilammide nel tempo può essere descritta come un processo in due fasi: prima una rapida diminuzione (circa 15 giorni), seguita da una diminuzione lenta e costante. Hanno inoltre riferito che l’invecchiamento riduce la capacità del polimero di flocculare una sospensione di caolino. Le spiegazioni per il meccanismo del processo di invecchiamento sono state collegate alla degradazione dei polimeri (Gardner et al., 1978), ai cambiamenti strutturali (Klein e Westerkamp, ​​​​1981; Kulicke e Nieske, 1981) e alla presenza di microrganismi o radicali liberi ( Haas). e McDonald). , 1972). Esistono dati limitati sull’effetto degli agenti ossidanti sull’efficienza della flocculazione del PAM. Ger e Soponkanaporn (1990) hanno riferito che il cloro riduceva leggermente l’efficienza di flocculazione del PAM cationico dopo 10 minuti di esposizione, e l’ozono riduceva significativamente la concentrazione effettiva del polimero nei primi minuti, dopodiché la concentrazione rimaneva costante. 16

Gli effetti di cloro, permanganato, radiazioni ultraviolette e le loro combinazioni sull’efficienza di flocculazione della poliacrilammide non ionica (PAM) sono stati studiati sulla base del test di torbidità dell’acqua al punto finale e del tempo di filtrazione.

È stato riportato che l’esposizione alle radiazioni UV non determina un cambiamento significativo nella torbidità, ma l’esposizione al cloro, al permanganato e al cloro alle radiazioni UV determina una riduzione delle prestazioni misurata dalla torbidità residua. Tuttavia, i test relativi al tempo necessario alla filtrazione hanno dimostrato che l’esposizione alla luce UV e/o al cloro o al permanganato ha comportato un miglioramento della filtrazione dell’impasto liquido, suggerendo che la sinterizzazione del polimero può produrre particelle più grandi, con conseguente intasamento e riduzione della resistenza. . contro il flusso che lo attraversa. Filtro poroso 4. L’analisi chimica è importante per determinare il destino finale dei polimeri utilizzati nel trattamento dell’acqua. Sono stati studiati numerosi metodi per monitorare i residui di polimeri nell’acqua. Un metodo consiste nel titolare i colloidi con un elettrolita carico in modo opposto utilizzando coloranti (Wang e Schuster, 1975; Parazak et al., 1987) o composti fluorescenti (Tanaka e Sakamoto, 1993) come indicatori. Tuttavia, questo metodo non è particolarmente sensibile, con limiti di rilevamento bassi, compresi tra 0,5 e 1 mg/L. Una variazione di questo metodo per i flocculanti cationici consiste nel misurare l’assorbanza a 680 nm dopo aver aggiunto gradualmente una soluzione standard del composto o,o-diidrossiazo legato al polimero 17.

30 (Kerry et al., 1986). Anche Masadom (2003) ha riportato un metodo simile utilizzando il cristalvioletto (CV) come indicatore e misurando la variazione di assorbanza a 590 nm utilizzando uno spettrofotometro convenzionale. Un altro metodo simile consiste nel controllare la torbidità aggiungendo acido tannico per far precipitare il polimero (Attia e Rubio, 1975). Sono stati sviluppati altri metodi per caratterizzare i polielettroliti sintetici. Goppers e Straub (1976) utilizzarono la cromatografia su strato sottile per distinguere il polimero dal rimanente monomero legato alla poliacrilammide cationica. La cromatografia ad esclusione dimensionale della poliacrilammide (SEC) è stata utilizzata per determinare il peso molecolare e la distribuzione del peso molecolare dei polimeri. Determinare piccole quantità di poliacrilammide anionico parzialmente idrolizzato (Belzley, 1985), poliacrilammide non ionico residuo nei fanghi di allume (Keenan et al., 1998) e poliacrilammide cationico ad alto peso molecolare (Soponkanaporn, 1991, 178). . L’elettroforesi su gel è stata utilizzata anche come strumento per determinare la distribuzione del peso molecolare dei polielettroliti sintetici a catena lunga (Smisek e Hoagland, 1990). Si dice che l’elettroforesi su gel abbia il vantaggio di una risoluzione più elevata e di un intervallo di peso molecolare molto più ampio rispetto alla SEC acquosa, con un limite superiore sulla dimensione della catena ben superiore al peso molecolare di qualsiasi polimero sintetico importante dal punto di vista commerciale. Lo svantaggio di questo metodo è che può essere utilizzato solo per polimeri caricati, mentre l’EC può essere applicato anche a polimeri non ionici. 18

Gascromatografia di pirolisi (Py-GC)

La gascromatografia-pirolisi-spettrometria di massa (Py-GC-MS) è un metodo importante per identificare i polimeri sintetici, sia qualitativamente che quantitativamente, da oltre 30 anni. Oltre a identificare i composti, la pirolisi viene utilizzata anche per rivelare la struttura dei copolimeri e studiare i modelli degli omopolimeri (Wang, 1999). Black et al. (1966) usarono Py-GC-MS dopo la separazione SEC per analizzare un copolimero ad alto peso molecolare di acrilammide e acrilato di sodio a bassa densità di carica (CD).

Molto importante è anche l’analisi delle impurità polimeriche come i residui di acrilammide.

I metodi attuali utilizzati per l’analisi dell’acrilammide residua includono la cromatografia liquida ad alte prestazioni con un rilevatore UV (Vers, 1999), la gascromatografia seguita da un rilevatore di desorbimento di elettroni (ECD) (Bologna et al., 1999) o la spettrometria di massa. (MS) è (O). et al., 2003). 5. Regole per l’utilizzo della poliacrilammide. Attualmente sono disponibili vari convertitori polielettrici e la presenza di monomeri non reagiti è preoccupante, in particolare monomeri di acrilammide ed epicloridrina, che sono tossici per l’uomo e gli animali. Per questo motivo, Svizzera e Giappone non consentono l’uso di polielettroliti, inclusa la poliacrilammide, nel trattamento dell’acqua potabile (Letterman e Bro, 1990). Altri paesi, come gli Stati Uniti e il Regno Unito, hanno fissato limiti ai livelli e alle dosi di inquinanti. 19

Negli Stati Uniti, quando i prodotti PAM vengono utilizzati per trattare l’acqua potabile,

La composizione e il dosaggio del monomero non devono superare lo 0,05% (in peso del polimero attivo) di monomero di acrilammide alla dose di 1 ppm (40 CFR), che corrisponde a una concentrazione teorica massima di 0,5 microgrammi per litro di monomero in acqua.

Rispetto agli Stati Uniti, il Regno Unito ha normative più severe: nessuna unità può contenere più dello 0,02% di monomero di acrilammide libero a seconda del contenuto di principio attivo, e la dose non deve mai superare una media di 0,25 ppm. Non superare 0,50 ppm di principio attivo.

Componenti (BS EN 1407: 1998 e BS EN 1410: 1998). Tuttavia, queste regole si concentrano solo sulla qualità dei prodotti stessi e non sulla qualità dell’acqua finale. Quando la poliacrilammide (PAM) entra in un sistema di acqua potabile, il PAM e i monomeri possono subire varie reazioni (come descritto nelle sezioni precedenti) che possono comportare un aumento o una diminuzione dei residui di acrilammide.

Nessuna di queste normative tiene conto dei potenziali cambiamenti residui nell’ACM nei sistemi di trattamento e distribuzione dell’acqua. Inoltre, non esistono raccomandazioni scientifiche per la selezione dei prodotti polimerici per la purificazione dell’acqua.

I prodotti polielettroliti vengono spesso selezionati empiricamente in base alle prestazioni e ai costi a livello di scala, e la potenziale degradazione dei polimeri durante la purificazione e la distribuzione solitamente non viene presa in considerazione.

Pertanto, è necessario valutare la degradazione dei polimeri in un sistema di trattamento dell’acqua per facilitare la selezione e l’uso dei prodotti polimerici nel trattamento dell’acqua potabile. 20

33 Metodi e materiali Questo capitolo descrive i metodi sperimentali utilizzati in questo studio. Ci sono tre sezioni principali in questo capitolo: analisi chimica del PAM, analisi UV del PAM e test di efficienza della sinterizzazione. Nelle prime due sezioni sono stati valutati e inclusi anche gli effetti combinati delle radiazioni UV e degli ossidanti chimici sui residui di acrilammide e sui residui ossidanti.

Il diagramma schematico dell’intero apparato sperimentale è mostrato nella Figura 3.1. Degradazione chimica del PAM Degradazione chimica (ossidanti) mediante UV combinato con ossidante residuo TOC, ACM Spettro UV Sinterizzazione Caratteristiche dell’azoto inorganico residuo Figura 3.1 Diagramma schematico del disegno sperimentale 1. Per questo studio sono stati selezionati tre prodotti di poliacrilammide.

Ricerca sulla poliacrilammide (PAM)

Alcune proprietà dei polimeri, come marca del polimero, forma, peso molecolare, tipo di carica, densità di carica e componenti principali, sono fornite dal produttore e sono elencate nella Tabella 3.1. I tre polimeri selezionati erano sotto forma di polvere a causa del loro contenuto di polimero attivo più elevato rispetto alle forme di emulsione o soluzione. Altre proprietà di questi tre polimeri differiscono l’una dall’altra. Ad esempio, l’anione A-3333P ha il peso molecolare (MW) più alto, pari a un milione di dalton,

e il catione C-3280 ha il peso molecolare più basso (4-6 milioni di dalton). I tre polimeri selezionati rappresentano tre tipi di PAM in termini di carica e componenti. Prima degli esperimenti sono state preparate soluzioni polimeriche allo 0,1% (in termini di sostanza secca). In questo studio, come matrice dell’acqua è stata utilizzata l’acqua nanopura prodotta da un sistema di purificazione dell’acqua da laboratorio Millipore. Prima di preparare le soluzioni madre, i solidi totali dei tre polimeri sono stati determinati essiccando una quantità specifica di polimero (ad esempio 0,5 g) in un forno a 105–110 °C per 3 ore e misurando la differenza di peso prima e dopo l’essiccazione (Appendice A). ).

I polimeri sono stati quindi sciolti in acqua calda (25–35°C) sotto agitazione per formare soluzioni acquose allo 0,1% sulla base dei solidi totali (ad esempio, per il 90% di solidi totali, 1,11 g di polimero disciolti in 1 litro di acqua). Per ulteriori esperimenti sono state preparate soluzioni polimeriche con una concentrazione di 10 mg/l da soluzioni allo 0,1%. Sebbene bassi livelli di PAM (tipicamente <1 mg/L) siano comunemente utilizzati negli impianti di trattamento dell’acqua, per la maggior parte degli esperimenti in questo studio è stata adottata una concentrazione di 10 mg/L a causa della bassa sensibilità dei metodi analitici. 22

35 Tabella 3.1 Proprietà del polimero (Polydyne Inc., 2004) Marchio del polimero Clarifloc N-3300 P Clarifloc A-3333 P Clarifloc C-3280 Forma del polimero Polvere bianca Polvere bianca Peso molecolare Polvere bianca Polvere bianca Peso molecolare Dalton Tipo Mol. carica 8%, ~10 milioni neutra 0 12 ~ 16 milioni anionica 30% 4 ~ 6 milioni cationica 55% componente principale acrilammide, omopolimero di acrilammide e acrilato di sodio, copolimero di acrilammide e copolimero di Adam Meckel * * Adam Meckel: Etanamina N, N -2 – Nt 1-osso-2-propenile) ossi, cloruro. 2. Ossidazione chimica della poliacrilammide. In questo studio sono stati utilizzati due tipi di agenti ossidanti chimici: cloro libero e permanganato di potassio. La degradazione dei prodotti PAM è stata valutata utilizzando diversi test, tra cui residuo di ossidazione, spettro/assorbanza UV, carbonio organico totale (TOC), residuo di acrilammide e residuo di azoto inorganico. I cambiamenti nei residui ossidanti sono stati utilizzati come indicatore indiretto della presenza e dell’entità delle interazioni che si verificano tra ossidanti e polimeri, poiché il rilevamento diretto dei cambiamenti nella struttura del polimero richiede tecniche più avanzate (ad esempio Py-GC-MS). Per valutare i cambiamenti nel contenuto totale di polimero sono stati utilizzati test di assorbimento del carbonio organico totale e spettrofotometria UV. Ad esempio, un livello di TOC inferiore significa che parte del carbonio organico viene convertito in forma inorganica.

La modificazione residua della poliacrilammide (PAM) nella soluzione polimerica è un problema serio a causa della sua tossicità.

L’azoto inorganico, come l’ammoniaca, è stato utilizzato come indicatore dell’idrolisi dei polimeri. I campioni sono stati analizzati in triplicato. 2.1 Test per cloro libero residuo ossidato. Una soluzione madre di cloro di circa 1000 mg/L è stata preparata da candeggina commerciale al 6% e la sua concentrazione è stata confrontata con una soluzione standard di tiosolfato di sodio N (Hach) secondo i metodi standard 4500-Cl G (metodi standard). Indagine sull’approvvigionamento idrico e sui servizi igienico-sanitari 1377). In questo esperimento, le dosi di cloro erano 5, 10 e 15 mg/L in termini di cloro per ottenere rapporti tra cloro e massa polimerica di 0,5, 1,0 e 1,5. Le condizioni di prova dettagliate sono riportate nella Tabella 3.2. Tabella 3.2 Condizioni sperimentali per la determinazione dei residui di agenti ossidanti Dosaggio del polimero Nome mg/l Cl 2, mg/l Agente ossidante KMnO 4, mg/l Tempo di esposizione, ora N-3300 P 10 5, 10, 15 2, 4, 6 5 A – 3333 F 10 5, 10, 15 2, 4, 6 5 C, 10, 15 2, 4, 6 5 200 ml di ciascuna soluzione di polimero con una concentrazione di 10 mg/l vengono posti in un bicchiere di vetro con una capacità di 250 ml e vi viene posta una certa quantità della soluzione originale di cloro. I contenitori di vetro utilizzati in questo studio sono stati lavati con acido. Immediatamente dopo la miscelazione, è stata prelevata un’aliquota da 20 ml per valutare il cloro residuo iniziale utilizzando il metodo di titolazione dello iodio (Appendice B). Questo metodo utilizza una soluzione standard di tiosolfato di sodio con 24 amido.

37 Indice di calibrazione per lo iodio libero rilasciato dall’eccesso di ioduro di potassio nel cloro (Metodi standard per l’esame dell’acqua e delle acque reflue, 1998). La fiala è stata poi tappata con un tappo di vetro e sigillata con un foglio di alluminio per evitare la possibile esposizione alle radiazioni UV. La bottiglia è stata posta su un agitatore meccanico e agitata a 200 giri al minuto per 5 ore. A determinati intervalli sono stati prelevati campioni da 10 ml per verificare la presenza di cloro residuo. Dopo 5 ore di reazione della poliacrilammide (PAM), la reazione è stata interrotta aggiungendo 2-3 gocce di soluzione 0,1 M di tiosolfato di sodio. È stato utilizzato un tempo di contatto di 5 ore per equilibrare le reazioni quando possibile. 2.2 Test del permanganato di potassio ossidato La rimanente soluzione da 1000 mg/L di KMnO 4 è stata preparata da 0,1 mg di polvere di KMnO 4 (Fisher) e sciolta in 100 ml di nanoacqua. Le dosi di permanganato utilizzate per ossidare la soluzione polimerica sono state di 10 mg/l 2, 4 o 6 mg/l in termini di KMnO 4 (Tabella 3.2). È stato utilizzato il metodo descritto nella sezione precedente (ossidazione con cloro) ed è stata valutata la variazione del permanganato residuo nel tempo. La concentrazione del permanganato di potassio è stata determinata direttamente misurando la sua assorbanza a 525 nm mediante uno spettrofotometro (HACH DR 4000U), poiché la sua concentrazione è direttamente proporzionale all’assorbanza misurata a 525 nm. Il metodo dettagliato è descritto nell’Appendice C25.

2.3 TOC e assorbimento/spettri di assorbimento UV. Il carbonio organico totale (TOC) delle soluzioni PAM (10 mg/L) è stato determinato utilizzando un analizzatore TOC Sievers.

La misurazione del TOC si basa sulla stima della massa di CO2 prodotta dall’ossidazione della materia organica attraverso una combinazione di radiazioni UV e ossidazione del persolfato di ammonio in condizioni acide (Levine et al. 2004). Per ciascuna misurazione, circa 30 ml di campione sono stati collocati in una fiala da 40 ml che misura 29 x 81 mm con un tappo a vite rivestito in Teflon e quindi inseriti nell’autocampionatore. I parametri del test sono stati programmati utilizzando un sistema informatico. Per valutare l’effetto dell’ossidazione sul contenuto di carbonio organico nella poliacrilammide, il contenuto di carbonio organico totale in tre PAM (soluzione da 10 mg/l) è stato determinato prima e dopo l’ossidazione con cloro a una concentrazione di 5, 10, 15 mg/l e è stato testato il permanganato di potassio ad una concentrazione di 2,4. Poliacrilammide (PAM) 6 mg/l per 5 ore. Un altro modo per misurare i residui polimerici è l’assorbanza/spettri UV. I campioni di polimeri sono stati scansionati prima e dopo l’ossidazione con cloro/permanganato da 190 a 300 nm utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis (Hach DR 4000U). Perché precedenti studi di laboratorio hanno dimostrato che la poliacrilammide raggiunge il massimo assorbimento nell’intervallo compreso tra 190 e 205 nm. Pertanto, l’assorbanza delle soluzioni PAM a 195 nm è stata impostata come standard per confrontare le variazioni di assorbanza prima e dopo le reazioni di ossidazione. I tempi di reazione sono arrivati ​​fino a 1 ora, che è vicino al tempo di ritenzione di alcuni impianti di trattamento dell’acqua. 26

2.4 Modifica del residuo di acrilammide

Contenuto residuo di acrilammide nelle soluzioni PAM

Testato utilizzando la gascromatografia (GC) e il rilevatore ad assorbimento di elettroni (ECD). L’acrilammide nei campioni acquosi è stata bromurata con acqua bromo satura (Fisher) per formare 2,3-dibromopropionammide e quindi estratta con acetato di etile (Fisher) per convertirsi nella più stabile 2-propenammide. La 2-bromammide è stata separata su una colonna capillare polare DBwax (polietilenglicole) (30 m × 0,25 mm, spessore della pellicola 0,25 μm) (J&W Scientific) e quindi rilevata utilizzando un rilevatore ECD. Il metodo dettagliato è mostrato nell’Appendice D. Poiché studi precedenti hanno dimostrato che il PAM cationico è più sensibile all’ossidazione, in questo studio è stata valutata solo la variazione residua di una soluzione di acrilammide di PAM cationico (10 mg/L). La soluzione è stata esposta a 15 mg/L Cl o 6 mg/L KMnO4 per 30 minuti, quindi la quantità rimanente è stata misurata mediante AFM. Sono stati studiati anche gli effetti combinati delle radiazioni ultraviolette che verranno spiegati nella sezione sui residui di azoto inorganico. 4000 dollari). Per ciascuna misurazione sono state utilizzate le procedure di analisi fornite dal fornitore dello strumento (Hach). 100 ml di una soluzione di polimero con una concentrazione di 10 mg/l sono stati ossidati con 10, 15 mg/l di cloro o permanganato a 4 e 27°C.

Sono stati testati 40 mg/L6 per 1 ora, quindi sono stati testati NH3-N, NO2-N e NO3-N e la poliacrilammide (PAM) è stata confrontata con i risultati del gruppo di controllo (nessun agente ossidante aggiunto alle soluzioni polimeriche). .

I metodi di prova per l’azoto inorganico sono riportati nella Tabella 3.3. Altri metodi analitici utilizzati nello studio sono presentati nelle appendici, modificati rispetto ai metodi standard o da altre fonti. Tabella 3.3 Metodi di test per l’azoto inorganico (Manuale dello spettrofotometro Hach DR4000, 2001) Metodo di determinazione dei parametri per il rilevamento delle interferenze ai limiti dello strumento Generale NH 3 -N Spettrometro DR4000U HACH 0,09 ppm, NO -NO-2, M, NO, NO, M3 – 2 – N Spettrofotometro DR4000U HACH ppm Pb 2+, Fe 2+, Fe 3+, NO – 3, agente fortemente ossidante e riducente NO – 3 -N Spettrofotometro DR4000U HACH 0,01 ppm Ca, Cl -, Fe 2+, Fe +, NO – 2, pH , agenti ossidanti e agenti riducenti Potente 3. Fotodegradazione della poliacrilammide Per studiare la fotodegradazione della poliacrilammide abbiamo utilizzato Lampada solare UV. I campioni di polimero sono stati esposti alla luce UV e la degradazione del PFA è stata valutata sulla base degli esperimenti descritti nelle sezioni seguenti. L’intensità UV applicata in questo esperimento era di circa 7 mW/cm2, che era vicina all’intensità UV della luce solare reale a mezzogiorno durante il periodo dell’esperimento (maggio 2004). È stato scelto un tempo di attesa di 30 minuti perché tempi di attesa più lunghi possono comportare temperature più elevate delle soluzioni polimeriche e tassi di evaporazione più elevati. Per misurare il volume perso per evaporazione, 50 ml della soluzione di lavoro del polimero sono stati esposti alla stessa luce per 30 minuti e il volume è stato misurato utilizzando un cilindro graduato. I risultati degli studi successivi sono stati aggiustati per la percentuale di perdite per evaporazione.

3.1 Cambiamenti nei polimeri causati dalle radiazioni UV

È stata valutata l’influenza della radiazione UV sul contenuto di TOC del PAM e sullo spettro UV. I metodi sono simili a quelli descritti nella Sezione II. 3.2 Modifica dei residui di acrilammide mediante irradiazione UV e combinazione con agenti ossidanti. Una soluzione di PAM cationico (C-3280) con una concentrazione di 10 mg/l è stata sottoposta a irradiazione UV per 30 minuti e/o agenti ossidanti (cloro e/o permanganato). Testato per residui di acrilammide. Le condizioni sperimentali utilizzando GC-ECD sono riportate nella Tabella 3.4. Tabella 3.4. Test per residui di acrilammide Nome del polimero Dose del polimero Cloro ultravioletto Tempo di esposizione al permanganato di potassio C mg/l 30 minuti C mg/l Minimo C mg/l Combinazione di radiazioni UV con cloro/permanganato. Questo esperimento ha studiato l’effetto della radiazione UV sull’ossidazione delle soluzioni PAM da parte di cloro/permanganato. 10 mg/lPAM29

La soluzione è esposta alla radiazione ultravioletta

Applicare una certa quantità di soluzione di cloro (o permanganato) per ottenere un residuo iniziale di 5, 10 o 15 mg/l come Cl 2 (o 2, 4, 6 mg/l). KMnO4 per l’ossidazione del permanganato). Sono stati prelevati campioni da 10 ml ogni 10 minuti ed è stato determinato il residuo di cloro (o residuo di permanganato) fino alla fine della reazione. La riduzione degli ossidanti residui in 30 minuti è stata confrontata con il loro recupero in 30 minuti senza esposizione ai raggi UV. 4. Caratteristiche della flocculazione. In questo esperimento, le prestazioni di sinterizzazione di PAM selezionati sono state valutate prima e dopo l’ossidazione e confrontate in base alla velocità di sedimentazione dell’impasto di caolino all’1,5%. Il metodo della velocità di sedimentazione è stato modificato da uno studio di Smith-Palmer et al. (1994). Per ciascuna serie di test di flocculazione, 15 g di caolino (Fisher) sono stati miscelati con 890 ml di nanoacqua e 10 ml di soluzione salina per almeno 1 ora. La soluzione salina contiene cloruro di sodio M (Fisher), cloruro di calcio M (Fisher) e cloruro di magnesio M (Fisher). La sospensione di caolino è stata quindi distribuita con incrementi di 30 ml tre volte (90 ml in totale) in un cilindro graduato da 100 ml. Successivamente, una certa quantità di soluzione polimerica è stata aggiunta al cilindro e il suo volume ha raggiunto 100 ml. Il cilindro è stato capovolto per 5 minuti sotto agitazione, quindi dopo 3 minuti è stata misurata la distanza di deposizione (cm) ed è stata calcolata la velocità di deposizione media (cm/min). Prima di testare l’efficienza di flocculazione dei polimeri, 30

Determinazione delle proprietà viscoelastiche dei gel di poliacrilammide

Caratteristiche delle proprietà viscose dei gel di poliacrilammide. Rapporto sul progetto di qualificazione principale: presentato alla facoltà del Worcester Polytechnic Institute in parziale soddisfacimento dei requisiti per il diploma di laurea in scienze Zachary Gautreaux 1 Peterpan, Jeremy, Jeremy, P. Thongpradit 1 1 Dipartimento di ingegneria biomedica, Worcester Polytechnic Institute 2 Dipartimento di fisica , Worcester Polytechnic Institute Data: 27 aprile, Poliacrilammide 2. Viscoelasticità 3. Professore di Colture Cellulari Kristen Billiard 1, Professore Consulente Principale. Nancy Burnham

2 Indice 1. Introduzione Informazioni di base Indentazione di sfere di gel di poliacrilammide, microscopia a forza atomica e meccanica del contatto hertziano, prove di trazione uniassiale e viscoelastica, approccio progettuale viscoelastico e viscoelastico. Microscopia a forza atomica, Test di trazione uniassiale, Test di reologia, Discussione, Raccomandazioni future, Riferimenti, Applicazioni, Tabella di confronto due per due, Protocollo di microsfere di indentazione di poliacrilammide, TATOMIC LOXYEN

3 Indice delle figure Figura 1: Struttura chimica del monomero di acrilammide Figura 2: Combinazione di modelli Hertz della punta del cono AFM Figura 3: Schema del campione sollecitato Figura 4: Test di rilassamento dello stress Figura 5: Figura 6: Figura 6: Target Figura 7: Lastra di vetro Metodo di polimerizzazione. Figura 8: Foglio di gel di poliacrilammide 13: Campione di poliacrilammide con nastro in velcro Figura 14: Due pezzi aggiuntivi di velcro con fori Figura 15: Posizione di caricamento corretta Figura 16: Vista della telecamera Figura 17: Sensore di forza Bohlin Gemini Figura 18: Diagramma schematico dei sistemi reologici. Figura 19: Scansione della frequenza Figura 20: Pressione di spinta

Nonostante il loro ampio utilizzo nella ricerca sulle colture cellulari, le proprietà meccaniche dei gel di poliacrilammide non sono chiare.

Per caratterizzare completamente questo gel sono stati utilizzati la microscopia a forza atomica, test uniassiali, reologia e indentazione sferica. L’intervallo dei moduli elastici kPa e kPa per la concentrazione del gel era rispettivamente del 5%/0,025% e dell’8%/0,08%, e il rapporto di Poisson era 0,45. Studi futuri che utilizzano la poliacrilammide come substrato di coltura cellulare dovrebbero mostrare come il gel si differenzia e riconoscere l’incertezza nei valori di rigidità.

8 1. Introduzione La poliacrilammide ha dimostrato di essere un metodo popolare per studiare la risposta delle cellule in coltura alla maggiore durezza ambientale. L’interesse per la poliacrilammide è nato grazie alla sua biocompatibilità ben testata e alle proprietà meccaniche regolabili. I substrati sono necessari per le tecniche di coltura cellulare per imitare fedelmente le condizioni naturali dei tessuti biologici, ed è noto che i gel di poliacrilammide sono preparati con proprietà meccaniche identiche ai tessuti molli, normali e patologici. Tuttavia, il potenziale della poliacrilammide come substrato di colture cellulari per studi in vitro è attualmente limitato dall’incertezza dei valori di durezza specifici.

Studiando le proprietà meccaniche dei gel di poliacrilammide, si prevede di stabilire un ampio intervallo di valori di durezza costanti per due concentrazioni di gel.

Ad oggi sono stati condotti un numero limitato di studi scientifici per chiarire i vari parametri meccanici che la poliacrilammide condivide con i tessuti molli normali. Nel tentativo di determinare i valori di rigidità relativi per diverse concentrazioni di poliacrilammide, il Dr. Yu Li Wang e colleghi hanno registrato un intervallo di valori di rigidità molto simili a quelli dei tessuti molli nativi ottenuti da test meccanici (Wang et al., 2002). Tuttavia, i risultati recentemente pubblicati dal Dr. Wang sono stati classificati come alquanto spuri da un gruppo di ricerca guidato dal Dr. Dennis Disher presso l’Università della Pennsylvania utilizzando un metodo di test alternativo (Engler et al., 2004). L’estensione di questi risultati e i risultati presentati in questo rapporto hanno implicazioni pratiche per lo studio delle interazioni cellulari sui substrati di poliacrilammide. È noto che le interazioni cellula-substrato influenzano varie proprietà cellulari come i tassi di proliferazione, i percorsi di differenziazione, la migrazione, l’adesione e il rimodellamento della matrice. L’influenza del substrato su queste proprietà può essere in gran parte spiegata dalle sue proprietà meccaniche.

Caratteristiche.

I requisiti meccanici del substrato sono adattati al tipo di cellula specifico. Pertanto, i valori sconosciuti della durezza della concentrazione della poliacrilammide limitano notevolmente la profondità delle opportunità di ricerca. L’obiettivo principale di questo progetto è trovare numeri affidabili per quantificare le proprietà meccaniche della poliacrilammide in un ampio intervallo di concentrazioni. Si spera che, utilizzando i quattro metodi, sia possibile effettuare una valutazione completa dell’affidabilità, dei vantaggi e delle capacità del metodo, consentendo di trarre una conclusione completa. Le proprietà elastiche sono determinate mediante test sperimentali progettati per la microscopia a forza atomica (AFM), indentazione della sfera, reologia dinamica e tensione uniassiale. Dopo una breve introduzione alle questioni rilevanti, questo articolo discute le procedure sperimentali e i risultati di ciascun metodo. Questi metodi verranno confrontati e analizzati per determinare l’intervallo di valori di durezza accettabili per concentrazioni specifiche di gel di poliacrilammide. I risultati di questo studio potrebbero stabilire uno standard per la composizione dei substrati di gel di poliacrilammide utilizzati nelle colture cellulari. 9

Informazioni di base sui gel di poliacrilammide

Studi precedenti hanno dimostrato che le cellule rispondono in modo diverso se coltivate su substrati con diversa rigidità meccanica. Le interazioni meccaniche tra cellula e substrato influenzano una serie di comportamenti cellulari (Benningo et al., 2002). Il gel di poliacrilammide è facile da preparare e molti esperti ritengono che fornisca un substrato adatto per la crescita cellulare perché può essere creato per imitare fedelmente le proprietà meccaniche del tessuto naturale. I ricercatori hanno fatto grandi passi avanti nell’attaccare le cellule ai substrati di gel di poliacrilammide. Tuttavia, si è rivelato difficile valutare con precisione le risposte cellulari risultanti dalle proprietà meccaniche di un substrato poiché non esiste uno standard chiaro per determinarne le proprietà meccaniche. Il dottor Yu-Li Wang e i suoi colleghi hanno tentato di determinare le proprietà dei gel di poliacrilammide utilizzando il metodo del punteggio delle perle. Inoltre, il Dr. Dennis Decher e colleghi hanno valutato il confronto dei valori di rigidità meccanica di diversi substrati di gel naturale e poliacrilammide utilizzando AFM (Engler, 2004). Sono stati ottenuti risultati convincenti che mostrano somiglianze tra diversi tipi di substrati. Per imitare l’ambiente e la struttura dei tessuti molli naturali, i ricercatori creano gel sintetici di poliacrilammide con proprietà simili a quelle dei tessuti umani sani e malati. Questi gel sono formati sciogliendo l’acrilammide e il monomero reticolato N,N’-metilenebisacrilammide (bis). La struttura chimica del monomero di acrilammide può essere vista nella Figura 1.

Struttura chimica del monomero di acrilammide

La polimerizzazione del gel di poliacrilammide è una reazione catalizzata da radicali liberi che produce lunghe catene legate da legami covalenti. I gel di poliacrilammide vengono solitamente posizionati tra due lastre di vetro perché l’ossigeno agisce come uno scavenger di radicali liberi e impedisce la polimerizzazione ([Guida], 2005).

Oltre alla facilità di fabbricazione, ci sono molti vantaggi nell’usare i gel di poliacrilammide come struttura per studiare le proprietà meccaniche a livello microscopico. Le proprietà meccaniche possono essere facilmente manipolate modificando la concentrazione di acrilammide e bisacrilammide senza causare alcun cambiamento nelle proprietà chimiche del gel.

Grazie alla loro natura morbida ed elastica, i gel di poliacrilammide forniscono un modello più realistico del tessuto fisiologico rispetto ad una superficie di vetro o plastica. Questo materiale gel ha proprietà ottiche che consentono ai ricercatori di ottenere immagini ad alta risoluzione per l’analisi strutturale. Inoltre, alcuni studi hanno incorporato sfere fluorescenti nei gel per analizzare ulteriormente le proprietà meccaniche con una risoluzione vicina a 2 μm (Benningo et al., 2002).

È possibile ottenere un’ampia gamma di valori di durezza semplicemente mantenendo una concentrazione costante di acrilammide totale variando la concentrazione del reticolante bisacrilammide. Studi precedenti hanno dimostrato che concentrazioni molto basse di bisacrilammide provocano la rottura della superficie del gel e il gel potrebbe non polimerizzare.

Wang e collaboratori hanno precedentemente dimostrato che una miscela di gel di acrilammide/bisacrilammide al 5–8% è un’impalcatura adatta per misurare le forze di trazione cellulare (Engler et al., 2002). Altrettanto importante

Per la piena concentrazione dei componenti del gel mantenendo lo spessore richiesto.

Lo spessore del gel non può essere calcolato dal volume della soluzione utilizzata. Lo spessore effettivo del gel è quattro volte il valore calcolato. Ciò è dovuto alla risposta del gel ai cambiamenti di temperatura, osmolarità e idratazione. Pertanto, è importante monitorare l’atmosfera del test e mantenere sempre condizioni di test adeguate quando si lavora con gel di poliacrilammide.

Le sezioni seguenti descrivono i principi e i metodi per determinare le proprietà meccaniche e viscoelastiche dei gel di poliacrilammide. L’indentazione a sfera, la microscopia a forza atomica e l’indentazione meccanica a contatto hertziano sono metodi standard per determinare la durezza dei materiali morbidi grazie alla loro tecnica semplice. Principi di base.

Seguendo i principi della meccanica hertziana, il valore di durezza può essere determinato utilizzando questo semplice metodo. Il dottor Yu-Li Wang della University of Massachusetts Medical School ha utilizzato questo metodo per la poliacrilammide (Pelham e Wang, 1997). I risultati di questo esperimento furono infine pubblicati in un articolo di ricerca del 2002 in cui veniva presentata la metodologia (Engler, 2002). Questo studio ha utilizzato metodi di ricerca simili con piccole modifiche.

Le lacune osservate nel metodo di ricerca precedente verranno analizzate per valutare ulteriormente l’efficacia dei metodi. La meccanica hertziana fornisce le basi e la teoria matematica per l’indentazione delle sfere. Tutti i problemi di meccanica hertziana richiedono diverse ipotesi per l’analisi matematica.

Le ipotesi prese in considerazione in questo studio sono le seguenti (Emil, 2002): Nel punto di contatto, la forma di entrambe le superfici di contatto può essere descritta da un polinomio omogeneo del secondo ordine in due variabili. Entrambe le superfici sono perfettamente lisce.

Equazioni differenziali delle tensioni di contatto e deformazioni-tensione-deformazioni di corpi omogenei,

Armonico e flessibile nell’equilibrio. La pressione scompare a grande distanza dalla zona di contatto. Le componenti dello sforzo di taglio sono pari a zero su entrambe le superfici all’interno e all’esterno della zona di contatto. Le componenti di sollecitazione normale su entrambe le superfici esterne alla zona di contatto sono pari a zero. La pressione totale sull’area di contatto è uguale alla forza che spinge insieme i due oggetti. La distanza tra due oggetti all’interno dell’area è zero, ma limitata all’esterno dell’area di contatto. In assenza di forza esterna, l’area di contatto si deteriora fino a un certo punto. Seguendo queste ipotesi, la derivazione matematica porta ad un’equazione della pavimentazione utilizzata per determinare il valore di rigidezza di base.

La derivazione dell’equazione originale può essere trovata nell’Appendice 10.3 (Wang et al. 2002): 2(ν)31 Ps E = (N/m2). L’equazione dR è dove E è il modulo di Young, ν è l’emissività s, Ps è la forza applicata alla palla, d è l’incidenza misurata della palla e R è il raggio della palla. Successivamente, sono stati condotti studi più avanzati e locali utilizzando la microscopia a forza atomica sulla poliacrilammide. Come nel caso dell’indentazione sferica, la sonda AFM viene abbassata sul campione e viene misurata la profondità dell’indentazione. Tuttavia, l’AFM opera su scala molto più piccola.

Il cantilever, inclusa la fossetta conica sulla punta, viene abbassato sul campione e quindi piegato. Il laser viene diretto verso la punta del cantilever e poi riflesso sul fotodiodo. La posizione del laser sul fotodiodo è correlata alla deflessione del cantilever, consentendo misurazioni precise. Il Dr. Dennis Discher dell’Università della Pennsylvania è un rinomato ricercatore che utilizza l’AFM nei suoi studi sui substrati cellulari (Discher et al., 2004). creare

14 La semplificazione del processo di acquisizione dati AFM su superficie compatibile è ancora in fase di sviluppo. L’attuale metodologia è descritta in un rapporto di Margot Frey del Worcester Polytechnic Institute (Frey et al., 2005). La punta conica AFM si adatta sia ai modelli Hertz conici che sferici. La punta si comporta come una sfera e rispetta l’equazione 2 fino ad una certa profondità di incavo.

Segue quindi il modello del cono di Hertz: 2 2Pc (1 v) E = , equazione 2 2d π tanθ con θ pari alla metà dell’angolo al vertice s, che viene misurato utilizzando il passo del reticolo della funzione del passo descritta nella metodologia AFM will. Figura 2: Formazione dei modelli hertziani della punta del cono AFM Per calcolare i modelli hertziani sono state utilizzate le seguenti equazioni. Il modello Hertz del giunto sferico è mostrato di seguito:14

(3/2) Fosforo = Dinaro del Bahrein. Equazione 3. Il valore di B è determinato dalla seguente equazione:

B 4 3 E (1 ν) R / nm (3 / (1/2) 2) = * * (nn), Equazione 4 2 dove R è il raggio del bordo ed è il rapporto di Poisson. Le tecniche di indentazione delle microsfere e AFM misurano le proprietà dei materiali locali. Le due sezioni successive descrivono i principi dei due metodi utilizzati in questo studio per ottenere le proprietà di massa dei gel di poliacrilammide.

Si spera che combinando le misurazioni su entrambe le scale si possa ottenere una comprensione completa di questo materiale complesso. Test di trazione ed elasticità uniassiale Oltre alle misurazioni dell’indentazione locale del cordone e dell’AFM, il test di trazione uniassiale fornisce le proprietà di massa del gel di poliacrilammide.

Una prova di trazione uniassiale è una misurazione meccanica diretta che monitora il comportamento a trazione di un materiale in una direzione. I due parametri importanti di questo metodo sono l’entità della forza per unità di superficie e la risposta a trazione del materiale sotto l’influenza di una forza nota.

Questi risultati combinati consentono la costruzione di una curva sforzo-deformazione e il calcolo del modulo di Young per determinare la durezza del materiale. Lo stress applicato ad un materiale può essere trovato dividendo la forza per l’area iniziale del campione a cui viene applicata la forza. Lo stress (σ) trovato nell’equazione 5 è definito come l’entità della forza per unità di area: = forza σ. Equazione 5 dell’area iniziale

Durante l’applicazione della pressione, il campione è soggetto a tensione assiale e compressione laterale.

Nella fig. La Figura 3 mostra un diagramma di un campione sottoposto a carico di trazione durante il test uniassiale. Figura 3: Rappresentazione schematica di un provino sottoposto a tensione assiale e compressione trasversale durante una prova di trazione monoassiale.

L’entità dello stress determina la deformazione di un corpo quando è sottoposto a stress. La deformazione tecnica è definita come la variazione di lunghezza divisa per la sua lunghezza originale. L’equazione base è rappresentata dalla lettera greca ε (epsilon), mostrata nell’Equazione 6: ε = lunghezza. Equazione 6. La lunghezza iniziale mostrata nella Figura 3 è relativamente piccola, o sollecitazione assiale geometrica, è mostrata come: CC = ‘C ε. Equazione 7 In passato, molti ricercatori hanno studiato le proprietà dei gel di poliacrilammide utilizzando il metodo di stretching uniassiale (Pelham e Wang, 1997). A causa delle proprietà fisiche del gel, un problema comune nelle prove di trazione era la sua adesione.

Sono stati sviluppati vari modelli di pinze per prevenire lo scivolamento e lo strappo del provino durante la prova di trazione. Un gruppo di ricerca ha utilizzato graffette per attaccarle al gel di poliacrilammide. In questo metodo, il peso dei morsetti veniva utilizzato per applicare una forza di trazione 16

Affinità per il campione di gel (Pelham e Wang, 1997).

Un altro gruppo guidato da Wong ha sviluppato un metodo che prevedeva l’applicazione di pezzi di pellicola trasparente con adesivo su entrambe le estremità di un campione di gel e l’applicazione di pesi noti utilizzando filo di rame (Wong, 2003). Sebbene i valori massimi di stress non siano stati discussi ampiamente negli studi precedenti, è importante mantenere le percentuali di stress entro il range di risposta della cellula. La ricerca sullo stress cellulare di Engler ha rilevato che lo stress massimo generato da una singola cellula è di circa il 15-25% (Engler, 2004).

I ricercatori hanno utilizzato le equazioni sforzo-deformazione menzionate sopra per trovare il modulo elastico. Inoltre, questo metodo di prova può determinare il coefficiente di Poisson calcolando la deformazione sotto deformazioni trasversali e assiali. I restanti tre metodi di questo progetto coinvolti in questo studio si basano sull’esatto rapporto di Poisson per calcolare il modulo elastico.

I ricercatori hanno utilizzato il rapporto di Poisson in un certo intervallo piuttosto che in un numero specifico: il gruppo di ricerca di Engler ha trovato il rapporto di Poisson nell’intervallo di 1, mentre il gruppo del Dr. Wang ha trovato un valore di 0,3 (Engler, 2004). Questi valori sono stati derivati ​​da un’ampia gamma di studi sul rigonfiamento dei gel di poliacrilammide negli anni ’80 (Geisler, 1980).

Oltre a misurare il rapporto di Poisson e il modulo di Young, il metodo della tensione uniassiale può essere utilizzato per determinare il comportamento viscoso dei materiali. Per studiare il comportamento viscoelastico del gel di poliacrilammide sono stati utilizzati diversi tassi di deformazione e un metodo di rilassamento dello stress con prove di trazione. Il dispositivo utilizzato per questo metodo consente di variare la velocità di deformazione, mentre i ricercatori precedenti non avevano esaminato il comportamento del gel a velocità di deformazione diverse. Si prevede che i valori di durezza dei materiali viscoelastici aumentino con l’aumentare della velocità di deformazione e diminuiscano con il tempo durante le prove di rilassamento dello stress. La Figura 4 mostra la maggior parte delle proprietà comportamentali dei materiali elastici e viscoelastici.

Tempo di stress

Figura 4: Test di rilassamento dello stress: a) Il materiale è essenzialmente elastico perché lo stress è costante. b) Il materiale si comporta come un fluido viscoelastico con un’entità dello stress costantemente decrescente. Per analizzare completamente le proprietà viscoelastiche della poliacrilammide, è stata studiata un’altra teoria della viscoelasticità attraverso test dinamici che includevano il movimento armonico. I concetti presentati hanno applicazioni specifiche nella tecnica di analisi reologica utilizzata in questo studio.

Come accennato in precedenza, i materiali semisolidi o viscoelastici mostrano proprietà liquide e solide a seconda della temperatura, della pressione e della pressione applicata nel tempo (Goodwin, 2000). Un reometro dinamico può essere utilizzato per determinare le proprietà viscoelastiche della poliacrilammide calcolando il modulo di taglio complesso sotto deformazione di taglio oscillatoria a bassa frequenza.

I gel di poliacrilammide mostrano un comportamento viscoelastico grazie alla loro rete tridimensionale reticolata e hanno la capacità di immagazzinare energia e flusso quando sottoposti a piccole deformazioni. Il reometro applica un momento oscillatorio armonico a un campione di gel di poliacrilammide e può misurare il movimento in uscita per calcolare la viscoelasticità18.

Concetto visivo dello sforzo di taglio applicato

Viene mostrata la deformazione o lo stress di taglio risultante. τ γ δ G * G δ G τ = sforzo di taglio (Pa) γ = sforzo di taglio G = modulo elastico (Pa) G = modulo di perdita (Pa) δ = angolo di fase (rad) G* = modulo complesso Figura 5: Viene visualizzato Il diagramma di un materiale viscoelastico mostra due onde sinusoidali sfasate: una che rappresenta lo stress di taglio e l’altra che rappresenta lo stress di taglio risultante.

Il modulo elastico (G) quantifica la quantità di energia elastica in un sistema, mentre il modulo di perdita (G) è l’energia meccanica persa a causa delle forze viscose. La risposta elastica di un dato gel è misurata dal modulo elastico (G), che è una misura della capacità del gel di immagazzinare energia elastica che può eventualmente essere recuperata.

La seconda misura, nota come fattore di perdita (G), determina la quantità di energia meccanica persa sotto forma di calore a causa delle forze viscose che agiscono sul gel. Infine, il rapporto G/G rappresenta la tangente dell’angolo di fase tra sforzo e taglio durante il taglio oscillatorio (Grattoni, 2001). L’angolo di fase determina il grado di viscoelasticità di un dato materiale.

I materiali elastici hanno angoli di fase prossimi a 0 (lo stress di taglio è in fase con lo stress di taglio applicato) e i materiali viscosi hanno angoli di fase intorno a 90 (lo stress di taglio è completamente fuori fase con lo stress di taglio applicato). Il modulo complesso (G*) è noto come modulo viscoelastico o modulo complesso e si ottiene dalla relazione sforzo-deformazione. Questo valore determina la resistenza complessiva al taglio oscillatorio. 19

Per un materiale linearmente elastico, la misura del modulo di taglio ottenuta con un reometro può essere convertita in un valore di modulo elastico utilizzando la seguente equazione:

E2(1 + ν) * p =. L’equazione 8 rappresenta il valore di G* utilizzato nei complessi calcoli dei coefficienti menzionati in precedenza. Come discusso nella sezione sulla sollecitazione uniassiale, il rapporto di Poisson ( ) è il rapporto negativo tra la sollecitazione trasversale e la sollecitazione uniassiale sotto carico assiale. Il calcolo del rapporto di Poisson è stato ottenuto da test uniassiali di gel di poliacrilammide. I ricercatori hanno utilizzato vari metodi reologici per determinare le proprietà viscoelastiche dei gel di poliacrilammide.

Butler et al. (1998) hanno utilizzato piccole sfere ferromagnetiche all’interno del gel per valutarne le proprietà reologiche. La rotazione angolare delle sfere è stata misurata quando le sfere magnetizzate venivano ruotate da un campo magnetico esterno. Butler et al. hanno riferito che è difficile interpretare la viscosità e il modulo elastico di un materiale da questi parametri. Altri studi includono l’uso della microbiologia per caratterizzare le proprietà dei gel di poliacrilammide. Dasgupta e i suoi colleghi hanno utilizzato sensori incorporati nel mezzo per valutare le proprietà viscoelastiche locali.

Questo studio ha dimostrato che la diffusione della luce quasi elastica, la spettroscopia delle onde diffuse e i metodi di tracciamento delle particelle basati su video hanno misurato con successo le proprietà dei gel di poliacrilammide (Dasgupta, 2005). È difficile confrontare i risultati ottenuti dal gruppo di ricerca di Dasgupta perché hanno utilizzato concentrazioni completamente diverse di monomero di acrilammide e reticolante di bisacrilammide per produrre campioni di poliacrilammide. È interessante notare che il team ha scoperto che i metodi di microreologia e reologia di massa hanno prodotto cambiamenti simili nei moduli elastici e di viscosità. Anche a livello locale, Schnurr et al. Hanno utilizzato la tecnologia dell’interferometria laser per misurare 20 perline.

su un substrato di poliacrilammide

Il limite di questo metodo era che non poteva fornire una risoluzione spaziale e temporale precisa a livello locale e non poteva misurare un gran numero di sfere simultaneamente (Dasgupta, 2005). Poiché l’attrezzatura non è disponibile, in questo studio è possibile utilizzare molte delle tecniche di microfeathering e di perline sopra menzionate. Il capitolo “Metodologia reometrica” ​​descrive più in dettaglio i test di vibrazione dinamica eseguiti per questo progetto. È importante notare la differenza nella scala delle proprietà misurate dei gel di poliacrilammide.

Approccio al progetto Questo progetto è stato unico in quanto non sono stati richiesti progettazione fisica o test.

Questo lavoro ha richiesto lo sviluppo di un metodo per caratterizzare le proprietà viscoelastiche dei gel di poliacrilammide. Per comprendere appieno le proprietà dei gel di poliacrilammide è stato necessario seguire un processo di progettazione strategica.

Per studiare le proprietà meccaniche dei gel di poliacrilammide, è stato necessario selezionare metodi di misurazione che determinassero le proprietà a livello macro e micro.

L’approccio di questo progetto di ricerca consiste nell’utilizzare diversi sistemi di misurazione per determinare la riproducibilità e la consistenza delle proprietà meccaniche dei gel di poliacrilammide.

Il team si è avvicinato alla descrizione di base del progetto del cliente ponendo diverse domande per definire chiaramente gli obiettivi, i vincoli e la funzionalità del cliente. Precedenti studi che utilizzavano gel di poliacrilammide sono stati attentamente esaminati e hanno dimostrato che le proprietà viscoelastiche del materiale non sono ben comprese.

Il team ha utilizzato strumenti di gestione del progetto per determinare che erano necessari più metodi per soddisfare le esigenze del cliente. Inoltre, il team ha deciso di affrontare il problema su scale diverse.

Consente un facile confronto con i valori pubblicati e una valutazione completa dei contenuti. Sulla base della ricerca preliminare, dei vincoli di budget e della disponibilità delle attrezzature, il team ha deciso di utilizzare quattro metodi: indentazione delle sfere, microscopia a forza atomica (AFM), test di trazione uniassiale e reologia. Nel campus WPI sono state condotte tre tecniche di indentazione della sfera, AFM e prove di trazione uniassiale.

Tuttavia, il team ha utilizzato un reometro presso la Malvern Instruments a Southborough, nel Massachusetts. I metodi di indentazione della sfera e AFM forniscono valori di durezza su scala locale, mentre i metodi di trazione e reometria uniassiali misurano le proprietà di massa. Utilizzando questi quattro metodi, il team sperava di far luce su alcuni dei 22 metodi.

La questione controversa riguarda i valori di durezza e fornisce informazioni sulle proprietà del gel a diversi livelli.

4. Progettazione Per formulare correttamente il metodo sperimentale per questo progetto, il processo di progettazione è descritto nel libro di testo Engineering Design:

Questa è stata seguita da un’introduzione basata su un progetto proposto da Dym e Little (Dym et al., 2004). La sezione successiva descriverà il processo generale utilizzato per sviluppare la struttura di questo progetto. Cercare di sviluppare un nuovo design sperimentale separa il processo di progettazione di quel progetto dal tipico processo di progettazione che prevede lo sviluppo di un dispositivo fisico.

Numerose interviste con i clienti hanno consentito un’analisi iniziale degli obiettivi e dei vincoli del progetto. Nel tentativo di ottenere proprietà viscoelastiche affidabili dai gel di poliacrilammide, attraverso interviste ai clienti sono stati identificati i seguenti obiettivi: creare proprietà viscoelastiche affidabili, rispettare il budget del progetto, non causare danni all’utente ed essere facili da usare.

Sulla base dei risultati dell’intervista, è stato sviluppato un elenco più specifico di requisiti da includere nell’albero degli obiettivi e nella tabella di confronto accoppiata. L’albero target può essere visto nella Figura 6 e il diagramma di confronto a coppie può essere trovato nell’Appendice. Grazie a questi strumenti, è diventato chiaro che l’obiettivo principale del progetto era trovare risultati riproducibili utilizzando metodi di misurazione individuali.

Robuste proprietà viscoelastiche dei gel di poliacrilammide economici e sicuri. Facilità d’uso. Analisi degli errori. Massimizzare la gamma di frequenza.

Per la reometria e l’AFM, massimizzare il numero di concentrazioni testate nell’intervallo kPa, massimizzare il numero di campioni testati per ciascuna concentrazione. Accessibilità E: Albero degli obiettivi: questo strumento di progettazione ha aiutato il team a stabilire le priorità degli obiettivi generali del progetto.

L’obiettivo finale di questo studio era ottenere proprietà viscoelastiche affidabili dei gel di poliacrilammide. Una tabella di confronto accoppiato (PCC) è stata inviata a tutti i clienti, inclusi il Dr. Billiard, il Dr. Burnham, Angie Tram e Margot Frey. Questi beneficiari sono stati identificati come principali soggetti interessati nei rispettivi studi, quindi era importante identificare le loro preoccupazioni. Per confronto, abbiamo anche ampliato il gruppo di studio PCC. Il PCC ha consentito al cliente e al team di valutare il livello di importanza degli obiettivi del progetto.

La carta PCC funge da ulteriore mezzo di comunicazione tra il cliente e il team per valutare e confrontare i livelli di comprensione. I numeri 1, 0,5 o 0 rappresentano i punteggi utilizzati per classificare il livello di importanza dell’obiettivo. Il punteggio indica il livello di significatività. Se ritiene che l’obiettivo sull’asse Y sia più importante dell’obiettivo sull’asse X, il grafico funziona inserendo un 1 nella casella.

Se ritiene che l’obiettivo sia più importante sull’asse X, quel numero è 0. Se ritiene che entrambi gli obiettivi siano ugualmente importanti, dovrebbe inserire il numero 0,5 nella casella bianca. Il feedback dei nostri clienti e del nostro team ha dimostrato che il raggiungimento di valori ripetibili è una priorità assoluta. Il numero massimo di concentrazioni e campioni che inizialmente il team pensava fosse maggiore di 25.

Utilizzando questo diagramma PCC, viene dimostrato l’errore dello stato critico.

Questo grafico PCC ha aiutato notevolmente il team nel processo di progettazione per ottenere risultati preziosi e soddisfacenti per i propri clienti. I risultati di questo processo sono riassunti di seguito. I risultati finali sono stati determinati dai clienti e l’obiettivo principale dello studio era garantire l’affidabilità complessiva dei metodi di prova utilizzati in questo studio. In base a questo valore, i parametri del test (come la gamma di frequenza) sono stati massimizzati. Il terzo obiettivo principale identificato dai clienti era aumentare il numero di test eseguiti per ottenere un grande volume di dati da analizzare. Dopo aver esaminato questi documenti, il gruppo di ricerca ha dovuto modificare lo scopo originale del lavoro. Ciò era caratterizzato da una piccola differenza nella percezione tra clienti e ricercatori. L’obiettivo iniziale del team era raccogliere quanti più dati possibili su un’ampia gamma di concentrazioni di poliacrilammide. Con il progredire del progetto, l’ambito del progetto si è ristretto e si è scoperto che i dati per due specifiche concentrazioni di gel di poliacrilammide erano più importanti di altre (8,0% acrilammide/0,08% bisacrilammide e 5,0% acrilammide/0,025% bisacrilammide). Speranza). I clienti hanno suggerito che queste concentrazioni sono importanti perché vengono spesso utilizzate nella ricerca sulle colture cellulari. Il Dr. Billiard utilizza ampiamente queste due concentrazioni nel suo laboratorio. Il 5%/0,025% rappresenta il tessuto sano normale e l’8%/0,08% rappresenta il tessuto malato o fibroso. Utilizzando un processo di progettazione, il team è stato in grado di dimostrare l’importanza di massimizzare il numero di campioni tra queste due concentrazioni specifiche. Infine, testare un minor numero di campioni individuali a concentrazioni multiple ha impedito al team di ottenere risultati definitivi. Ciascuna tecnologia selezionata presenta vantaggi e svantaggi. Il team ha valutato i pro e i contro di ciascun metodo elencato nell’appendice e ne ha anche identificati 26.

Obiettivo del progetto Nelle prime fasi del processo di progettazione, il team ha dovuto decidere il metodo più appropriato per misurare le proprietà viscoelastiche dei gel di poliacrilammide.

Esistono molti strumenti in letteratura per misurare le proprietà viscoelastiche, ma non sono adatti per vari motivi, tra cui la mancanza di attrezzature e il budget limitato. Sebbene nel campus WPI fosse disponibile un viscosimetro, non era adatto per le misurazioni richieste per i gel di poliacrilammide. Il viscosimetro utilizza un mandrino per applicare il taglio unidirezionale al campione ed è limitato a campioni viscosi o liquidi. Come il viscosimetro, la reometria capillare si è rivelata un metodo di test inadatto poiché il campione deve contenere una componente di flusso per ottenere risultati accurati. Numerosi altri metodi che sono stati utilizzati per caratterizzare le proprietà viscoelastiche dei materiali in gel includono la micrometria con trappola laser, la torsometria magnetica cellulare, la misurazione lineare eccitata piezoelettricamente e l’elastografia a ultrasuoni unidimensionale. Tutti i metodi sopra indicati forniscono dati interessanti ma non possono essere utilizzati in questo progetto perché l’attrezzatura non è disponibile. La tabella seguente mostra le limitazioni di ciascun metodo. Limitazioni del metodo sperimentale L’attrezzatura di misurazione di precisione con trappola laser non è disponibile, il costo dell’attrezzatura per misurare la torsione magnetica cellulare non è disponibile, il costo dell’attrezzatura per misurare la reologia della mobilità piezoelettrica lineare non è disponibile, il costo del flusso ultrasonico 1D, il è richiesto il costo della spinta 1D, è richiesta l’attrezzatura. Limitazioni dei metodi alternativi. Questo strumento di progettazione ha contribuito a limitare i possibili metodi sperimentali. 27

I micrometri a trappola laser misurano le proprietà meccaniche locali utilizzando una trappola laser a infrarossi e uno scanner galvanico (Velegol, 2001).

La torsometria citomagnetica utilizza un campo magnetico per ruotare piccole sfere magnetiche in un gel e misura la rotazione angolare della coppia applicata in modo da poter calcolare parametri specifici (Butler, 1998). La reometria lineare stimolata piezoelettricamente ha il vantaggio di utilizzare un cantilever per applicare uno sforzo di taglio oscillante a un campione di gel in un ambiente umidificato (Parsons, 2002). Infine, l’elastografia ad ultrasuoni prevede una complessa configurazione del trasduttore che applica una compressione uniassiale al campione da testare (Chen, 1996). Infine, quattro tecniche di microscopia a forza atomica, impronta sferica, tensione uniassiale e reologia, si sono rivelate le più adatte. Il capitolo sulla metodologia riportato sotto questo rapporto metterà in evidenza i vantaggi di ciascuno di questi quattro metodi. Per raggiungere gli obiettivi del progetto, il team ha creato un diagramma di flusso che mostra i possibili modi per ottenere tutte le informazioni necessarie per gli obiettivi del progetto. La tabella morfologica viene utilizzata per aiutare il team a valutare i metodi per caratterizzare le proprietà dei gel di poliacrilammide visualizzando le prestazioni medie e i valori di progettazione. Le funzioni definiscono cosa dovrebbe fare un progetto e gli strumenti descrivono i possibili modi in cui un team può eseguire determinate funzioni. 28

La funzione del tensiometro reologico con indentazione della sfera AFM fornisce il rapporto di deformazione di Poisson uniassiale.

Tecnica di compressione uniassiale, determinazione della riproducibilità, metodo di dimensionamento delle sfere per il metodo di indentazione delle sfere, tipi di piastre tra i calibri, tipi di piastre per la misurazione della reologia, tipi di metodi ad anello, risultati dell’analisi locale, risultati del confronto tra AFM e indentazione delle sfere, confronto di reologia e prova di trazione uniassiale. Determinare un intervallo di valori di durezza affidabili per una data concentrazione. Utilizzare risultati specifici e affidabili provenienti da metodi di prova AFM, reologia, indentazione sferica e trazione uniassiale per stimare l’intervallo di durezza per una concentrazione specifica. specifico. Tabella 2: diagramma morfologico che identifica le possibili modalità per raggiungere l’efficacia del progetto. Dopo aver utilizzato questo processo di progettazione, abbiamo deciso di utilizzare quattro metodi: indentazione con sfera, AFM, prova di trazione uniassiale e reologia. Tutti questi metodi possono determinare il modulo di Young dei gel di poliacrilammide e ognuno di essi presenta vantaggi unici. Ad esempio, il metodo di prova di trazione uniassiale misura il rapporto di Poisson, mentre i metodi di indentazione sferica e AFM misurano le proprietà su scala locale. Alla fine, abbiamo concluso che i nostri clienti erano più interessati a trovare una tecnologia affidabile che a massimizzare la gamma di concentrazioni testate. 29

Metodologia. Lo scopo del capitolo seguente è descrivere in dettaglio i metodi sperimentali per i quattro metodi di prova utilizzati in questo studio per determinare le proprietà meccaniche dei gel di poliacrilammide.

Ciascun metodo è descritto individualmente, descrivendo le impostazioni richieste, i passaggi eseguiti per raccogliere i dati e i calcoli utilizzati per ottenere i risultati. Le fonti di variabilità sono state eliminate controllando le condizioni ambientali (temperatura, umidità, bagnatura del gel) nel tentativo di mantenere la coerenza nell’analisi dei risultati. Questo è stato monitorato per garantire una concentrazione di gel uniforme durante tutto il processo sperimentale.

I gel di poliacrilammide utilizzati in questo studio sono costituiti da soluzioni madre di acrilammide e N,N’-metilenebisacrilammide.

Entrambe le soluzioni sono state ottenute da Bio-Rad e diluite con acqua distillata e Hepes 1 M (pH 8,5) alle concentrazioni corrispondenti: 40% p/v. per acrilammide e 2% p/v. per la bisacrilammide. Dopo aver preparato una soluzione ben miscelata utilizzando il protocollo descritto nell’Appendice 10.2, la miscela deve essere degassata per garantire un’adeguata polimerizzazione. Infine, alla soluzione vengono aggiunti persolfato di ammonio al 10% e TEMED (N,N,N,N-tetrametiletilendiammina) per indurre la polimerizzazione. Dopo aver colato i gel utilizzando il metodo appropriato, discusso più dettagliatamente nella sezione Metodologia di questo rapporto, i gel sono stati conservati a 4°C in 50 M Hepes (Wang et al., 2002). Il protocollo originale è stato progettato per produrre gel spessi 70 μm necessari per l’AFM.

Pertanto, per ogni singolo metodo, sono state necessarie piccole modifiche durante la fase di polimerizzazione del protocollo. Tre metodi di pressatura delle sfere, prova di trazione uniassiale e 30

La reologia richiede gel più densi.

Il protocollo presentato da Wang et al. È stato proposto di versare gel tra un vetrino attivo e un vetrino coprioggetto. Degasare la soluzione e tappare il gel durante la polimerizzazione è molto importante perché l’ossigeno agisce come uno scavenger di radicali liberi e impedisce la polimerizzazione. Una polimerizzazione insufficiente determina proprietà meccaniche instabili e imprecise durante i test. Nel tentativo di eliminare fonti di errore sperimentale, la polimerizzazione dei gel è stata effettuata tra due lastre di vetro contenenti una soluzione sfusa di acrilammide/bis. La camera richiede due lastre di vetro parallele, tappi di gomma, parafilm e gel di agarosio. Due guarnizioni di gomma sono state posizionate tra le lastre di vetro e il fondo è stato sigillato con gel di agarosio all’1% e parafilm per evitare che le soluzioni fuoriessero dalla camera. Per chiudere e sigillare i vetrini con guarnizioni in gomma e gel di agarosio sono state utilizzate graffette. Invece di preparare 5 ml di soluzione tradizionale, il nuovo sistema di cristallizzazione richiedeva 180 ml di soluzione. Le dimensioni dello spazio tra le due lastre di vetro sono visibili nella Figura 7. Figura 7: Metodo di polimerizzazione della lastra di vetro: i tamponi di gomma sui lati e il gel di agarosio sul fondo impediscono alla soluzione di fuoriuscire.

Per garantire che la soluzione fosse ben miscelata, la soluzione di acrilammide è stata posta su un agitatore per cinque minuti prima di degassare.

Inoltre, dopo il degasaggio, la soluzione è stata nuovamente agitata e sono stati aggiunti persolfato di ammonio e TEMED. La soluzione è stata versata rapidamente nell’intercapedine tra le lastre di vetro e lasciata indurire per 1 ora per l’aumento del volume del gel. Il foglio di gel di poliacrilammide risultante, mostrato nella Figura 8, è stato quindi tagliato in campioni di gel più piccoli con le forbici. Figura 8: foglio di gel di poliacrilammide. Un foglio di grandi dimensioni consente di produrre più campioni nelle stesse condizioni con lo stesso spessore del campione. Per soddisfare i requisiti specifici dei quattro metodi, sono state apportate piccole modifiche al protocollo di cui sopra. La metodologia tecnologica riportata di seguito copre questi cambiamenti specifici e le ragioni dietro di essi. Eventuali modifiche al protocollo di cui sopra sono state apportate con attenzione in modo da non influenzare le proprietà complessive del gel testato. Indentazione della sfera Lo scopo del test di indentazione della sfera era valutare l’effetto del diametro della sfera sui valori di durezza relativa. Questo approccio si basa su una lacuna identificata nella ricerca condotta dal Dr. Wang. Questa variazione è stata ottenuta conducendo esperimenti su tre sfere d’acciaio di diverso diametro (0,64 mm, 1 mm e 2 mm). Tutti gli altri componenti (densità e materiali lucidanti) delle sfere sono stati normalizzati per eliminare le variabili sperimentali.

Per creare diverse distanze nella direzione z è stato utilizzato un microscopio invertito con un micrometro collegato.

Gel di poliacrilammide a diverse concentrazioni sono stati preparati simultaneamente per eliminare tutte le possibili variazioni sperimentali (condizioni ambientali e tempo consentito per il degasaggio e la polimerizzazione). Immediatamente dopo il completamento della polimerizzazione, ciascun gel è stato immerso in una soluzione HEPES 50 mM per mantenere l’idratazione e il rigonfiamento continuo della poliacrilammide. La sezione 5.1 fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione della poliacrilammide. Una modifica prevede l’aumento dello spessore del gel a 1,75 mm invece di 3,45 mm per adattarsi alle limitazioni del microscopio. L’esperimento ha richiesto la rimozione della soluzione tampone HEPES per eliminare la necessità di includere variabili di galleggiabilità nei calcoli della forza applicata. Solo la soluzione tampone circostante è stata rimossa dal gel in esame, lasciando umidi gli altri due gel. Questa fase è stata eseguita consentendo a tutta la soluzione di drenare liberamente dalla superficie del gel per garantire condizioni di test soddisfacenti in cui non era presente alcuna pellicola liquida visibile sulla superficie. Partendo da una sfera del diametro di 0,64 mm, sono state effettuate dieci misurazioni su gel di ciascuna concentrazione (0,025,5% e 0,08,8%). Dopo che sono state effettuate 10 misurazioni sul primo gel, questo viene riposto in HEPES 50 mM mentre viene testato il gel successivo. Infine, ciascun campione di gel è stato utilizzato con ciascuna delle tre sfere. Gli effetti dell’essiccazione del gel non sono completamente compresi, quindi è stato mantenuto un valore costante durante l’esperimento per eliminare questo fattore. A causa dell’elevata variabilità nella misurazione manuale dei punti di contatto, sono state effettuate misurazioni multiple. L’obiettivo era determinare la distanza tra il fondo della palla e la superficie superiore del gel in un intervallo fisso di oltre 20 posizioni diverse su 33.

gelatina

Inizialmente, si pensava che questo processo fosse la distanza dalla superficie superiore del gel al punto in cui cessava di essere visibile quando il punto focale si spostava ulteriormente nel gel. Dopo la valutazione, è stato stabilito che questo metodo non forniva una misurazione accurata del fondo della palla. Invece, la misurazione effettuata era dovuta alla diffrazione della luce attraverso il gel e attorno ad una sfera sulla superficie del gel. Per risolvere questo problema è stato applicato un nuovo metodo di misurazione. Innanzitutto, è stato focalizzato sulla superficie del gel e il micrometro è stato impostato su zero.

Ciò è stato fatto focalizzando la lente sui difetti superficiali del gel. Questa parte della misurazione può in gran parte spiegare la differenza nei valori delle impronte digitali misurati, poiché le particelle sulla superficie del gel possono interferire con la comprensione della posizione della superficie del gel. È importante che la dimensione della superficie sia ad almeno un diametro dal bordo esterno della palla in modo che il gel possa aderire alla superficie della palla. Il centro della sfera era la seconda dimensione per determinare la posizione verticale del raggio della sfera. Il centro era definito come il punto in cui attorno al bordo visibile della sfera si trovava un fascio di luce perfettamente circolare e di maggiore intensità.

Quando l’obiettivo veniva spostato leggermente verso l’alto o verso il basso, si verificava un chiaro cambiamento nella luce focalizzata, rendendo questa misurazione abbastanza coerente e necessaria per tenere conto del campo di messa a fuoco. Questo intervallo comprende la deviazione standard osservata nei risultati ottenuti e come risultato dei cambiamenti introdotti dall’occhio umano. Questo intervallo era originariamente di 40 µm, ma è stato ridotto a circa 20 µm attraverso test approfonditi. La distanza di indentazione è stata calcolata utilizzando la seguente equazione, dove Ms è la posizione verticale della superficie del gel misurata, R è il raggio noto della sfera e Mc è 34.