بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE) لبروتينات الدم ، جون سي. موردوك وروبرتا و. إلينجتون قسم العلوم البيولوجية جامعة نورث وسترن إيفانستون ، إلينوي حصل جون على درجة البكالوريوس من جامعة إلينوي عام 1984 وعلى درجة الدكتوراه. في عام 1991 من جامعة نورث وسترن. منذ عام 1992 ، كان محاضرًا ومديرًا للمختبرات الجامعية في جامعة نورث وسترن في قسم العلوم البيولوجية. حصلت روبرتا على درجة البكالوريوس في علم الأحياء من كلية بارات ، ليك فورست ، إلينوي ، وشهادة الماجستير من جامعة لويولا في شيكاغو. منذ عام 1986 ، كان مدرسًا / تحضيريًا في جامعة نورث وسترن في برنامج العلوم البيولوجية الجامعية. أعيد طبعه من: Mordacq و JC و RW Ellington Ellington Polyacrylamide الكهربائي للهلام (PAGE) لبروتينات الدم. الصفحات 15-44 ، في دراسات مختبرة للتدريس المخبري ، المجلد 15 (CA Goldman ، محرر).
وقائع ورشة العمل / المؤتمر الخامس عشر لجمعية تعليم المختبرات في علم الأحياء (ABLE) ، 390 صفحة. – سياسة حقوق النشر: على الرغم من اختبار التمارين المختبرية في مجلدات ABLE وإيلاء الاهتمام الواجب للسلامة ، يجب على الأشخاص الذين يؤدون هذه التمارين تحمل المسؤولية الكاملة عن المخاطر. تتنصل جمعية التعليم المخبري في علم الأحياء (ABLE) من أي مسؤولية عن السلامة فيما يتعلق باستخدام التمارين في مجلدات John C. Murdoch and Roberta W. Ellington Association for Laboratory Education in Biology (ABLE) ~ 15 رفضًا.
محتويات مقدمة الرحلان الكهربي بولي أكريلاميد
16 مخطط الطالب … 17 مقدمة … 17 الأهداف … 18 معلومات أساسية … 18 إجراءات المختبر اليومية إجراءات المختبر تقرير المختبر اليومي … 32 البيانات … 33 مخطط تدفق الإجراءات … 34 شكر وتقدير .. .35 الأدب المقتبس منه … 35 الملحق أ: تجريبي الخاتمة … 36 الملحق ب: الدليل التحضيري … 37 الملحق ج: مواد الموارد … 43 مقدمة يتم استخدام هذا التمرين المخبري في جامعة نورث وسترن في علم الأحياء التمهيدي لمدة فصل دراسي تسلسل يغطي موضوعات بيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء. في هذا التمرين ، يتعلم الطلاب كيفية استخدام العديد من التقنيات الشائعة في العديد من المعامل البحثية.
تشمل هذه التقنيات الترسيب التفاضلي والطرد المركزي واستخراج المنظفات. يأخذ معظم الطلاب هذه الدورة في سنتهم الثانية ، ومعظمهم إما متخصصون في علم الأحياء أو طلاب يأخذون منهج تمهيدي الطب. يتم تدريس الطلاب في مجموعات من 24 ويعملون في أزواج. يتشارك كل زوج من الطلاب مادة هلامية مع زوج آخر. إنه ترتيب مناسب لا يتطلب سوى ستة أنواع من المواد الهلامية لكل غرفة.
يتطلب هذا المعمل الكثير من التحضير والتنظيم.
على الرغم من أن هذا المعمل يتم بواسطة الطلاب في أقل من 3 ساعات ، إلا أنه من الضروري أن يقضي طاقم الإعداد في اليوم التالي في تلطيخ وتوجيه المواد الهلامية حتى يتمكن الطلاب من القدوم في اليوم الثالث والتحقق من نتائجهم. يمكن العثور على قائمة مفصلة بالمواد والبروتوكولات في الملاحق. اعتمادًا على مستوى الطلاب ، قد يلزم تعديل هذا التمرين. على سبيل المثال ، هناك القليل من النقاش حول روابط ثاني كبريتيد ودورها في بنية البروتين.
يحتوي المخزن المؤقت للعينة المستخدم في هذا التمرين على عامل اختزال يخلق بيئة من الثيول الزائد الذي يقلل من جميع روابط ثاني كبريتيد في البروتينات. وبالتالي ، يتم تغيير طبيعة البروتين إلى وحدات فرعية بروتينية فردية. تختلف المواد الهلامية متعددة الأكريلاميد المستخدمة في هذه الممارسة عن تلك المستخدمة في المعامل البحثية لأنه لا يوجد هلام سائب ، يشار إليه أحيانًا على أنه نظام عازلة متقطع. جل التكديس عبارة عن هلام منفصل يُسكب فوق هلام الجري ويحتوي على نسبة أقل من مادة الأكريلاميد ومخزن درجة حموضة مختلف.
بسبب هذه الحالة ، ينتهي الأمر بالبروتينات بالتراكم في نطاقات ضيقة مركزة في قاع الهلام.
تتمتع المواد الهلامية المكدسة بدقة أفضل ، ولكنها تتطلب وقتًا أطول للتحضير وتتطلب سكب المواد الهلامية عموديًا. يتم سكب المواد الهلامية التي نستخدمها أفقيًا ، مما يوفر المزيد من الوقت ويكون أقل عرضة للتسرب. يمكن العثور على مناقشة حول تكديس المواد الهلامية وطرق أداء البولي أكريلاميد الكهربائي في دليلين مختلفين للمختبر: Sambrook et al. (1989) و Ausubel et al. (1990).
الرحلان الكهربي متعدد الأكريلاميد مقدمة الخطوط العريضة للأنواع المختلفة من اللوني تمثل تقنيات قوية ومستخدمة على نطاق واسع لفصل مخاليط الجزيئات البيولوجية إلى مكوناتها الفردية. ولكن كما قد تتخيل ، فقد طور علماء الكيمياء الحيوية الأذكياء والكادحون على مدار القرن الماضي طرقًا عديدة لفصل الجزيئات عن المخاليط.
أهمها طرق الرحلان الكهربي المختلفة ، منها أنواعها الرئيسية الرحلان الكهربي متعدد الأكريلاميد (PAGE) والرحلان الكهربي الاغاروز. يعتبر الرحلان الكهربي للهلام متعدد الأكريلاميد ، بكل أشكاله المختلفة ، الطريقة الأكثر استخدامًا على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية المعاصرة. تعتمد جميع طرق الرحلان الكهربي على حقيقة أن الجزيئات المشحونة في محلول مائي تهاجر في مجال كهربائي. من المهم أيضًا الأنواع المختلفة لتقنيات فصل الدفعات مثل الترسيب التفاضلي ، والتمسخ التفاضلي ، والاستخراج التفاضلي ، وكلها تستند إلى خصائص قابلية الذوبان للأنواع الجزيئية ذات الأهمية.
على الرغم من أنه لم يتم استخدامه على نطاق واسع الآن كما كان من قبل
لا تزال تقنيات الدُفعات ضرورية للعديد من التطبيقات ، خاصة تلك التي يتم فيها تنقية كميات كبيرة من المواد. في هذا التمرين المعملي ، ستستخدم الترسيب التفاضلي ورحلان هلام البولي أكريلاميد الكهربائي جنبًا إلى جنب مع الطرد المركزي واستخراج المنظفات لتجزئة الخليط المعقد من البروتينات الموجودة في خلايا الدم الحمراء في الثدييات وبلازما دم الثدييات وتحديد بعض البروتينات المكونة.
من بين الفئات المختلفة للجزيئات العضوية داخل الخلايا ، هذه هي البروتينات
والتي هي بلا شك الأكثر تغيرًا من حيث الحجم والهيكل والوظيفة. لذلك ، كان عزل وفصل البروتينات عن المصادر الطبيعية تقليديًا أحد المجالات الرئيسية للبحث في الكيمياء الحيوية وما زال مستمراً حتى اليوم. نظرًا لأن البروتينات هي الجزيئات النشطة للخلية ، فإن هذه الجزيئات الكبيرة والمعقدة تهم الباحثين العاملين في العديد من مجالات البحث البيولوجي المعاصر.
العديد من البروتينات مستقرة فقط في ظل نطاق محدود نسبيًا من الظروف التجريبية.
إذا تم تجاوزها ، يحدث التمسخ نتيجة التعديل داخل الجزيء و / أو التجزئة مع فقدان النشاط البيولوجي لاحقًا. تعتبر طريقتا التجزئة اللتان ستكتشفهما في هذا التمرين المعملي مفيدًا بشكل خاص لتنقية البروتينات لأنه في ظل ظروف يتم التحكم فيها بعناية ، يكون تحلل الجزيئات ضئيلًا. يمكن اعتبار الترسيب التفاضلي طريقة القوة الغاشمة لتجزئة خليط من البروتينات ، حيث يتم استخدامه عادةً لتقسيم الخليط إلى عدد صغير من الكسور المختلفة ، يحتوي كل منها على أنواع جزيئية مختلفة.
علاوة على ذلك ، قد يوجد أي بروتين معين في أكثر من جزء واحد ، على سبيل المثال ، قد يكون 80٪ موجودًا فيما يسمى بالجزء الرئيسي بنسبة 10٪ لكل جزء في جزئين صغيرين. يعتبر الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد أكثر تعقيدًا لأنه يمكن أن يفصل البروتينات الفردية ، حتى تلك المتشابهة تمامًا من الناحية الهيكلية. تم اختيار دم الثدييات كمصدر بروتين للعزل في هذا التمرين لعدة أسباب. إنها مادة تحتوي على مكون سائل (بلازما) ومكون خلوي ، ويمكن فصل الاثنين بسهولة عن طريق الطرد المركزي.
تحتوي البلازما على العديد من البروتينات في المحلول.
تحتوي الخلايا على بروتينات هيولي قابلة للذوبان داخل الخلايا وكذلك بروتينات غشائية (محيطية ومتكاملة). دم الثدييات بروتينات وبالتالي ، يوفر غشائية وبروتينات حشوية وبروتينات خارج الخلية للعمل معها. تبدأ بفصل الخلايا عن البلازما بالطرد المركزي.
ثم تُغسل الخلايا لإزالة آثار بروتينات البلازما ثم تُحلل بعد ذلك في وسط ناقص التوتر. يتم فصل أغشية الخلايا (الأشباح) عن البروتينات السيتوبلازمية بواسطة الطرد المركزي عالي السرعة. وفي الوقت نفسه ، ستخضع كمية صغيرة من البلازما لطريقتين مختلفتين للترسيب الجزئي ، حيث يتم استخدام كبريتات الأمونيوم والإيثانول كعوامل ترسيب. في نهاية المطاف ، سيكون كل العجز
الرحلان الكهربي بولي أكريلاميد مع ديثيوثريتول (DTT)
يتم معالجة الكاشف الذي يكسر روابط ثاني كبريتيد وتعريضه للرحلان الكهربي للهلام متعدد الأكريلاميد في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم المنظف (SDS). يتم تلخيص المعلومات الأساسية حول الجوانب المختلفة لهذا التمرين المخبري أدناه. الأهداف عند الانتهاء من هذا التمرين المعملي ، يجب أن تكون قادرًا على: 1. تسمية بروتينات البلازما الرئيسية في الثدييات ووصفها بإيجاز.
اسم وشرح بإيجاز البروتينات الرئيسية المرتبطة بغشاء خلايا الدم الحمراء للثدييات.
3. اشرح معنى الترسيب الجزئي والذوبان والتحلية وثابت العزل الكهربائي. وصف الآليات التي تسبب بها كبريتات الأمونيوم والإيثانول ترسيبًا جزئيًا للبروتينات. 4. اشرح المبادئ التي يقوم عليها الرحلان الكهربي. قل ما تعنيه المعادلة Ez = fv. اشرح كيف يتم تعريف μ ولماذا هو مهم. اشرح ما هو المقصود بكثافة الشحنة.
أخبر ما هي SDS-PAGE وكيف تختلف عن PAGE. وصف دور بولي أكريلاميد و SDS في الطريقة الكهربي. 6. أخبر كيف يتم تحضير عينات البروتين لـ SDS-PAGE ولماذا يتم تحضيرها بهذه الطريقة. قم بتضمين دور DTT في مناقشتك. 7. تفسير بيانات SDS-PAGE. خلفية بروتينات البلازما Mammalian plasma عبارة عن مركب سائل معقد بمعنى أنه يحتوي على أنواع جزيئية مختلفة. يأتي هذا التعقيد من دوره البيولوجي كوسيلة نقل رئيسية في جسم الثدييات ، لأنه كما يمكنك أن تتخيل ، هناك العديد من المواد الجزيئية المختلفة التي يجب توزيعها.
تؤخذ جزيئات المغذيات من الجهاز الهضمي وتنتقل في جميع أنحاء الجسم وتصل إلى جميع الخلايا. يتم جمع جزيئات النفايات من جميع الخلايا وتسليمها إلى مواقع التخلص المناسبة: في المقام الأول الكلى والرئتين والجلد. يتم التقاط الجزيئات التنظيمية من خلايا الغدد الصماء المختلفة ونقلها إلى الأنسجة المستهدفة المختلفة. تظهر إنزيمات البلازما المشتقة من الأنسجة بكميات متغيرة ، خاصةً في حالة الإصابة أو المرض.
ثم هناك جزيئات الدفاع:
أجسام مضادة ضد الكائنات الحية الغازية بالإضافة إلى مجموعة من الجزيئات التي لها القدرة على التجمع وتشكيل الجلطات لمنع النزيف عند تمزق الأوعية الدموية. العديد من هذه المواد عبارة عن بروتينات بحد ذاتها أو يتم نقلها بواسطة بروتينات النقل.
تم تنقية ما يقرب من 100 بروتين مختلف وتم تمييزها من البلازما البشرية ، ولكن لا يزال يتعين توصيف العديد من البروتينات الثانوية. يمكن سرد بروتينات بلازما الدم الرئيسية في الثدييات على النحو التالي: الألبومين ، وهو سلسلة أحادية الببتيد تحتوي على ما يقرب من 580 من بقايا الأحماض الأمينية ، هو البروتين الأكثر وفرة في بلازما الثدييات (35 مجم / مل 45). يبلغ وزنه الجزيئي حوالي 66 كجم. (تذكر أن دالتون ، التي تساوي كتلة ذرة الهيدروجين ، هي الوحدة الأساسية للكتلة الجزيئية ، والاختصار kd يشير إلى كيلودالتون.
19 أو 1000 دالتون بولي أكريلاميد الكهربائي.
الألبومين ، القابل للذوبان في كبريتات الأمونيوم نصف المشبعة ، هو بروتين البلازما الرئيسي الأكثر حمضية. عندما تم تطوير تقنيات الرحلان الكهربي لأول مرة ، كانت البلازما واحدة من أولى المواد التي تمت دراستها. الجلوبيولين هي عائلة كبيرة من بروتينات البلازما التي تم تحديدها في الأصل بناءً على خصائص قابليتها للذوبان. تشمل الجلوبيولين جميع بروتينات البلازما غير القابلة للذوبان في كبريتات الأمونيوم المشبعة جزئيًا.
تتنوع α globulins وفقًا لوزنها الجزيئي ووظيفتها. البروثرومبين (72 كيلو دالتون) ، البروتين الرئيسي لنظام التخثر ، هو أحد غلوبولين ألفا. تشكل بيتا جلوبيولين النوع الفرعي الثاني من الجلوبيولين. بيتا جلوبيولين هي أيضًا مجموعة متنوعة من الجزيئات من حيث الحجم والوظيفة. الترانسفيرين ، أكثر غلوبولين بيتا وفرة ، لها نطاق وزن جزيئي يختلف من كيلو دالتون. γ تحتوي الجلوبيولين ، وتسمى أيضًا الغلوبولين المناعي ، على جزيئات الأجسام المضادة.
عادة ما توجد ثلاث فئات رئيسية (المعينة A و G و M) وفئتان فرعيتان (D و E).
الغلوبولين المناعي G (IgG) هو ثاني أكثر بروتينات وفرة في البلازما البشرية (18 مجم / مل). تتكون جميع جزيئات γ-globulin من أربع سلاسل متعددة الببتيد متصلة بواسطة روابط ثاني كبريتيد: سلسلتان ثقيلتان (4555 كيلو دالتون) وسلسلتان خفيفتان (2535 كيلو دالتون). إنها تختلف في طبيعة السلاسل المعنية. تتراوح أوزانهم الجزيئية من kd ، باستثناء IgM ، وهو جزيء أكبر بكثير عند حوالي 1000 كيلو دالتون. الفيبرينوجين هو بروتين التخثر الأكثر وفرة في البلازما (مجم / مل).
وزنه الجزيئي 340 كجم.
تحتوي بروتينات غشاء الدم في الثدييات على عدة أنواع مختلفة من الخلايا. يتذكر الجميع ما يسمى بالخلايا الحمراء (كرات الدم الحمراء) وخلايا الدم البيضاء (الكريات البيض) من بيولوجيا المدرسة الثانوية. خلايا الدم الحمراء هي الأكثر وفرة إلى حد بعيد (الخلايا لكل مليلتر من الدم في الذكور البشرية ، الخلايا لكل مليلتر في الإناث البشرية).
تعد الكريات البيض ، التي يوجد منها عدة أنواع ، أكثر ندرة (خلايا لكل مليلتر من الدم في البشر). توجد خلايا الدم الحمراء في الثدييات كخلايا رفيعة ، مستديرة ، تشبه القرص ثنائي التجويف تفتقر إلى النوى والعضيات الأخرى داخل الخلايا. بسبب هذا الهيكل البسيط نسبيًا وحقيقة أنه يمكن استخراج البروتينات بسهولة باستخدام المنظفات مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، فليس من المستغرب أن تصبح كريات الدم الحمراء في الثدييات موضوعًا بحثيًا مفضلاً لعلماء الكيمياء الحيوية وعلماء الأحياء الخلوية.
نتيجة لذلك ، يمكن القول أن بروتينات غشاء خلايا الدم الحمراء في الثدييات هي البروتينات الأكثر شهرة في أي خلية.
ستجدها تمت مناقشتها بالتفصيل وموضحة في صفحات في بيولوجيا الخلية الجزيئية (الإصدار الثاني) بقلم دارنيل وآخرون. وفي صفحات الكيمياء الحيوية (الطبعة الثالثة) بقلم شتاير. عندما تتعرض بروتينات غشاء كريات الدم الحمراء في الثدييات لـ SDS-PAGE وملطخة بـ Coomassie Brilliant Blue R ، كما تفعل في هذا التمرين ، تظهر 10 نطاقات رئيسية تقريبًا.
هذه النطاقات الرئيسية مرقمة بالنطاق 1 ، وهو أكبر بروتين في الجزء العلوي من الجل. النطاقان 1 و 2 هما مونومرات α (الوزن الجزيئي 240 كيلو دالتون) و β (220 كيلو دالتون) من سبيكترين ، وهو بروتين غشاء محيطي موضعي السيتوبلازم. Spectrin ، وهو بروتين طويل السلسلة موجود في شكل ثنائي αβ ، يعمل كمكون رئيسي في الهيكل الخلوي.
Ankyrin 2.1 و 2.2 عصابات الرحلان الكهربي بولي أكريلاميد
يوجد بروتين غشاء محيطي آخر على الجانب السيتوبلازمي. Ankyrin هو بروتين كروي يبلغ وزنه الجزيئي حوالي 200 كيلو دالتون ، وهو أيضًا أحد مكونات الهيكل الخلوي. يحتوي Ankyrin على مجالين للربط: أحدهما للسبكترين والآخر لبروتين النطاق عبر الغشاء 3. وبالتالي ، فإنه يعمل على ربط كبلات سبيكترين بالجانب الداخلي من غشاء كرات الدم الحمراء.
بروتين باند 3 هو الأول من بروتينين رئيسيين في الغشاء. إنه موجود كديمر من سلسلتين متطابقتين ، يحتوي كل منهما على 929 من بقايا الأحماض الأمينية ووزن جزيئي يبلغ حوالي 93 كيلو دالتون. يحتوي كل مونومر على مجال C- طرفي (509 وحدة بنائية) يقع في طبقة ثنائية فوسفوليبيد من الغشاء ومجال طرفي N (420 وحدة بنائية) يمتد إلى سيتوبلازم كرات الدم الحمراء. بروتين النطاق 3 هو بروتين عبر الغشاء متعدد الكتلة.
يدخل مجاله الطرفي C عبر الغشاء ويخرج من غشاء خلايا الدم الحمراء اثني عشر مرة.
يعمل بروتين النطاق 3 كقناة أنيون (مسام عبر الغشاء يمكن من خلاله تبادل الأنيونات مثل الكلوريد والبيكربونات). بالإضافة إلى وظيفة النقل الخاصة به ، يحتوي بروتين Band 3 على مجال ربط ankyrin في نهايته N السيتوبلازمية. وبالتالي ، تعمل جزيئات النطاق 3 كمواقع يتم توصيل الهيكل الخلوي بها. بروتين الفرقة 3 وفير في غشاء خلايا الدم الحمراء.
وهو يشتمل على ما يقرب من ثلث بروتين الغشاء الكلي.
بروتين باند 3 هو أيضًا بروتين سكري يحمل بقايا قليلة السكاريد الصغيرة في مجاله الخارجي. بروتين النطاق 4.1 ، حوالي 82 كيلو دالتون من الوزن الجزيئي ، هو بروتين غشاء محيطي آخر على السطح السيتوبلازمي للغشاء ومكون آخر من مكونات الهيكل الخلوي. إنه بروتين كروي ذو مجالين ملزمين: أحدهما للسبكترين والآخر للأكتين. البروتين خماسي النطاقات هو أكتين ، وهو بروتين كروي بوزن جزيئي يبلغ 43 كيلو دالتون.
الأكتين هو بروتين غشاء محيطي آخر على الجانب السيتوبلازمي يشارك في الهيكل الخلوي. تتبلمر مونومرات الأكتين لتشكل خيوطًا وتشارك في الهيكل الخلوي عند تقاطع كبلات الطيف ، والتي ترتبط ببروتين النطاق 4.1.
بروتين 6 نطاقات هو glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ، وهو إنزيم يحفز تحويل glyceraldehyde-3-phosphate إلى 1،3-bisphosphoglycerate. إنه أحد الإنزيمات الرئيسية في مسار التحلل ، وهي مجموعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية المشاركة في الطاقة الحيوية الخلوية. إنزيم نازعة الهيدروجين Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase هو بروتين رباعي النواة بوزن جزيئي 140 كيلو دالتون.
تتكون كل وحدة من وحداتها الفرعية الأربعة المتطابقة من سلسلة بولي ببتيد واحدة (35 كيلو دالتون) من حوالي 330 من بقايا الأحماض الأمينية.
أحد بروتينات الغشاء الأخيرة التي يجب ذكرها هو الجليكوفرين ، وهو الثاني من بروتينين غشاء رئيسيين. لم يتم ترقيم الجليكوفرين في التسلسل لأنه لا يلطخ باللون الأزرق كوماسي. يتكون من 131 بقايا حمض أميني بوزن جزيئي يبلغ حوالي 30 كيلو دالتون.
وهو عبارة عن بروتين غشائي أحادي التمرير ، مما يعني أن سلسلة البولي ببتيد تمر عبر طبقة ثنائية الفوسفوليبيد مرة واحدة فقط. تقع نهايته الأمينية (حوالي 70 من بقايا الأحماض الأمينية) على الجانب الخارجي من غشاء خلايا الدم الحمراء. هذا المجال الخارجي غني بالجليكوزيلات بشكل كبير مع العديد من بقايا الكربوهيدرات ، وهذه السكريات تمثل 64٪ من الوزن الجزيئي للبروتين المنقى. تظهر دراسة متأنية للملخص أعلاه أنه لم يتم كتابة أي شيء عن هوية النطاقات 4.2 و 4.9 و 7 من البروتين الموضح في الشكل في بيولوجيا الخلية الجزيئية.
هذا لأن وظيفة هذه البروتينات لم يتم اكتشافها بعد. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم ذكر البروتينات والأدوسين والتروبوميوسين ، والتي تظهر كمكونات مهمة للهيكل الخلوي لخلايا الدم الحمراء في الشكل في بيولوجيا الخلية الجزيئية. وذلك لأن هذه البروتينات لا تبدو وفيرة بما يكفي لتكون موجودة بشكل روتيني في المواد الهلامية SDS-PAGE.
يقدر الرحلان الكهربي بولي أكريلاميد بـ 21 بروتينًا هيوليًا
أن السيتوبلازم لخلية ثديية نموذجية يحتوي على إنزيمات وبروتينات تنظيمية وبروتينات هيكلية (أي الهيكل الخلوي) حوالي عدة مئات من أنواع جزيئات البروتين المختلفة. ومع ذلك ، فإن سيتوبلازم كرات الدم الحمراء فريد من ناحيتين.
أولاً ، يحتوي على نسبة بروتين أعلى من الخلايا الجسدية العادية. ثانيًا ، ما يقرب من 75٪ من هذا البروتين هو الهيموجلوبين (15 كيلو دالتون وحدة فرعية) ، وهو صبغة الجهاز التنفسي التي تعطي خلايا الدم الحمراء وظيفتها الأساسية (تحمل الأكسجين وثاني أكسيد الكربون في جميع أنحاء الجسم).
النسبة المتبقية تشمل أنواعًا مختلفة من الإنزيمات والجزيئات الهيكلية والجزيئات التنظيمية.
لكن العديد من البروتينات الموجودة عادة في الخلايا الجسدية لا توجد في خلايا الدم الحمراء. يتم تدميرها مع النواة في عملية نضوج خلايا الدم الحمراء.
الهطول الجزئي الترسيب الجزئي هو تقنية تعتمد على قابلية الذوبان المختلفة للجزيئات المختلفة في المحلول. أنت الآن على دراية بمفاهيم الكراهية للماء والماء من حيث علاقتهما بالسلاسل الجانبية للأحماض الأمينية والأحماض الدهنية ورؤوس وذيول الدهون الفوسفورية والجزيئات العضوية بشكل عام. أنت أيضًا على دراية بمفهوم الشكل العام والقطبية لجزيئات الماء ، حيث تكون ذرات الهيدروجين موجبة نسبيًا وذرات الأكسجين سالبة نسبيًا.
لذلك ، لن تواجه مشكلة في إدراك أنه عندما تذوب الجزيئات في الماء (ولا تنس أن جميع الكائنات الحية هي في الأساس عبارة عن خليط منظم للغاية من الجزيئات العضوية المذابة في الماء والمحاطة بأغشية و) ، كل جزيء محاط بـ غشاء. غلاف من جزيئات الماء موجه نحو المادة المذابة بحيث تكون الطاقة الحرة بحد أقصى.
تُعرف هذه الظاهرة بالقابلية للذوبان.
يمكن إذابة الجزيئات أو المجموعات الأيونية والجزيئات أو المجموعات القطبية بواسطة غلاف يتكون من عدة طبقات من جزيئات الماء المنظمة بشكل خاص ، بينما يمكن إذابة الجزيئات الموجودة في منتصف الطريق على المقياس المحبة للماء بواسطة قذائف رقيقة جدًا. تذوب جزيئات الماء التي تكون إلى حد ما عشوائي.
الاتجاهي وعقد بشكل فضفاض للغاية. بعد التأسيس لمفهوم أن الجزيئات في المحاليل المائية يتم حلها بقشور جزيئات الماء ، يترتب على ذلك أن هذه الأصداف تعمل على منع الجزيئات الذائبة من التلامس مع بعضها البعض ، علاوة على أي تغيير في البيئة المائية من شأنه أن يزعج البيئة .
من خلال ترقق القشرة أو إزالتها بحيث يمكن للجزيئات الذائبة الفردية أن تتلامس مع بعضها البعض ، قد تسمح الأصداف للمذابات بالالتصاق ببعضها البعض بإحكام أكثر من احتوائها على جزيئات الماء. قد تتشكل العناقيد العملاقة وتستقر على شكل رواسب في المحلول. هذا هو ما يحدث في الأساس في حالة نقص هطول الأمطار. كيف يمكن تغيير البيئة المائية بحيث تتعطل الأصداف؟
هناك ثلاث طرق رئيسية:
تغيير الأس الهيدروجيني أو إضافة الملح أو إضافة مذيب عضوي قابل للامتزاج بالماء. هذه هي التقنية الثانية والثالثة التي ستستخدمها في هذا التمرين المعملي. يُعرف الترسيب الجزئي للبروتينات عن طريق إضافة الملح باسم التحلية.
من الناحية النظرية ، يمكن استخدام أي ملح لا تتفاعل مكوناته الأيونية مع البروتينات بشكل لا رجعة فيه ، ولكن في الممارسة العملية ، يعتبر الملح المختار كبريتات الأمونيوم (NH 4) 2 SO 4. كبريتات الأمونيوم شديدة الذوبان في الماء. لإنتاج محلول مشبع ، يجب إضافة 767 جرامًا لكل لتر من الماء.
لذلك ، هناك نطاق واسع يمكن من خلاله تغيير التركيز. أيضًا ، كل من أيونات الأمونيوم وأيونات الكبريتات شديدة الذوبان. لذلك ، فهي فعالة جدًا في فصل جزيئات الماء عن بروتينات القشرة القابلة للذوبان. في هذا التمرين ، تقوم بتخفيف محلول مشبع من كبريتات الأمونيوم بكمية متساوية من البلازما في درجة حرارة الغرفة. سيتم الحصول على خليط
رحلان بولي أكريلاميد الكهربائي عند مستوى تشبع بنسبة 50٪.
في ظل هذه الظروف ، من المتوقع أن تترسب الجلوبيولين ولكن يبقى الألبومين في المحلول. يحدث الترسيب الجزئي للبروتينات مع إضافة مذيب عضوي قابل للامتزاج بالماء مثل الإيثانول بسبب تغير ثابت العزل الكهربائي (ε) للمحلول.
ثابت العزل هو كمية تصف قوة القوة التي تمارسها شحنة كهربائية على أخرى. تذكر أن جزيئات الماء عبارة عن هياكل قطبية وأن شحناتها داخل الجزيئية تمارس قوى على جزيئات الماء الأخرى والمواد المذابة مثل البروتينات. (في الواقع ، هذه القوى بين الجزيئات هي التي تؤدي إلى ظاهرة الذوبان الموصوفة في الفقرات السابقة.) عندما يتم خلط المذيبات العضوية غير القطبية نسبيًا مثل الميثانول والإيثانول والبروبانول بالماء ، فإنها تعمل على فصل جزيئات الماء عن الماء.
يقللون من بعضهم البعض وبالتالي يقللون من القوة التي يمكن أن يمارسوها على بعضهم البعض. بالنسبة للمياه النقية ، ε = 80 statcoulomb 2 / dyne-cm 2 بينما بالنسبة للإيثانول النقي ، ε = 32 statcoulomb 2 / dyne-cm 2 (كلا القيمتين تقريبية). تؤدي إضافة كميات متزايدة من الإيثانول إلى المحلول المائي للبروتينات إلى تقليل ثابت العزل الكهربائي تدريجيًا وتتداخل أخيرًا مع قابلية ذوبان البروتين حتى يصبح تفاعل البروتين والبروتين أقوى من تفاعل البروتين والماء وترسب البروتينات.
في هذا التمرين ، ستضيف الإيثانول المطلق بنسبة 1: 2 (المجلد: المجلد) إلى البلازما عند 0 درجة مئوية. سيكون الخليط الناتج 33٪ إيثانول مع ثابت عازل حوالي 60. في ظل هذه الظروف ، من المتوقع أن تترسب الجلوبيولين ولكن يبقى الألبومين في المحلول. SDS-PAGE SDS-PAGE يرمز إلى طريقة الرحلان الكهربائي حيث يتم استخدام هلام البولي أكريلاميد كمادة مصفوفة ويتم تضمين المنظف ، كبريتات دوديسيل الصوديوم ، في المخزن المؤقت للرحلان الكهربي.
كيف ترتبط هاتان المادتان بحركة الجزيئات المشحونة (البروتينات في حالتنا) في المجال الكهربائي؟
بادئ ذي بدء ، إذا كنت تأخذ أنبوبًا زجاجيًا على شكل حرف U ، فاملأه بمحلول بروتيني في محلول مناسب ، ثم ضع الكاثود في أحد ذراعي الأنبوب والأنود في الآخر ، وقم بتطبيق تيار كهربائي ، البروتينات في المحلول يبدأ في الهجرة في المجال الكهربائي.
بعد مرور بعض الوقت ، لن يكون تركيز البروتينات المختلفة في أجزاء مختلفة من الأنبوب منتظمًا:
تتركز الأنواع المشحونة إيجابياً في الذراع الكاثودية بينما تتركز الأنواع سالبة الشحنة في ذراع الأنود. سيكون أي فصل يتم تحقيقه غير مستقر للغاية ، ومع ذلك ، بمجرد إيقاف التيار ، إذا لم يتم تحريك الجهاز بحيث يتم خلط الجزيئات المنفصلة جسديًا ، فإنها ستعود بسرعة إلى مواقعها العشوائية بسبب الانتشار.
لذلك ، لكي يكون الفصل الكهربائي عمليًا ، كان على الباحثين إيجاد طريقة لإبقاء الجزيئات المنفصلة منفصلة بعد فصلها. تم حل هذه المشكلة التقنية عندما تم تطوير طرق لأداء العملية الكهربي في مصفوفة مسامية. كان الورق هو أول مادة تستخدم كمادة مصفوفة.
تم تشبع الورق بمخزن مؤقت ، وتم تطبيق خليط بروتيني على أصل مشابه للكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (باستثناء أن الأصل كان عادة في منتصف الورقة وليس في طرف واحد) ، وتمت تغطية الورقة.
قضيب تعليق نهايته مغمورة في حمامين عازلة: أحدهما يحتوي على الكاثود والآخر على الأنود. لمنع الورق من الجفاف ، تم وضع النظام بأكمله في غرفة هوائية.
استخدم نظام ذو صلة ، وهو الرحلان الكهربي لأسيتات السليلوز ، طبقة رقيقة من أسيتات السليلوز المشبعة بالعازل على غطاء بلاستيكي محاط بغرفة مماثلة. كان كلا النظامين يعملان بشكل جيد ، ولكن كان من الصعب تنفيذهما من الناحية الفنية ، حيث كان من الصعب إلى حد ما حماية الورق أو طبقة أسيتات السليلوز ، وسرعان ما تم استبدالهما بأنظمة مصفوفة هلامية أسهل بكثير. كان جل النشا هو أول مادة هلامية تستخدم في الرحلان الكهربائي. في وقت لاحق ، تم تفضيل هلام الاغاروز وجل بولي أكريلاميد. المواد الهلامية في سرير أفقي أو رحلان بولي أكريلاميد 23 سرير عمودي (الشكل 2.1).
نظرًا لأنه يمكن إحاطة أسِرَّة الهلام ، فإن التجفيف والتسخين المتزامنين مع مرور تيار كهربائي عبر وسط تجفيف متزايد لا يمثل مشكلة على الإطلاق.
يظهر الشكل الكيميائي لتكوين بولي أكريلاميد في الشكل 2.2. الأكريلاميد هو جزيء المونومر الذي يبلمر ، N ، N- ميثيلين-ثنائي-أكريلاميد (المعروف ببساطة باسم bis) هو جزيء الارتباط المتقاطع الذي يتبلمر مع الأكريلاميد وثنائي كبريتات الأمونيوم (NH 4) 2 S 2 O 8 و N ، N ، N ، N-tetramethylethylenediamine (TEMED) هي محفزات بلمرة.
عن طريق تغيير كمية مادة الأكريلاميد في خليط البلمرة ، يمكن تغيير كمية الارتباط المتبادل في البوليمر. يؤدي تقليل درجة الارتباط المتقاطع إلى زيادة متوسط حجم المسام في مصفوفة بولي أكريلاميد ، وهذا يؤثر بشكل مباشر على سرعة حركة الجزيئات ذات الأحجام المختلفة في المصفوفة. لذلك ، يمكن للمرء أن يختار تركيز بولي أكريلاميد الذي يذوب البروتين المعين بشكل أفضل. الشكل 2.1. رسم تخطيطي لجهاز تجريبي للرحلان الكهربائي للبلاطة الهلامية من البولي أكريلاميد.
الشكل 2.2. كيمياء البلمرة للمواد الهلامية بولي أكريلاميد.
يمكن وصف الأساس النظري للعملية الكهربي على النحو التالي: يتم وصف حركة الجزيء المشحون في مجال كهربائي بالمعادلة Ez = fv ، حيث E هي شدة المجال الكهربائي (بالفولت لكل سنتيمتر) و z متساوية.
هي الشحنة الصافية على الجزيء ، v هي سرعة الجزيء (بالسنتيمتر / الثانية) و f هي معامل الاحتكاك الذي يعتمد على حجم وشكل الجزيء. إعادة ترتيب المعادلة ، v = E ze z = fv أو v = E f يؤكد على أن السرعة ، v ، تتناسب مع شدة المجال الكهربائي ، E ، والشحنة الصافية للجزيء ، z ، وتتناسب عكسيًا. إلى معامل الاحتكاك ، ص. وبالتالي ، كلما كان المجال الكهربائي أقوى وزادت الشحنة الصافية ، زادت سرعة تحرك الجزيء ، بينما كلما كان شكله أكبر و / أو غير متماثل ، قلت قوة الاحتكاك أو جر zf.
الرحلان الكهربي بولي أكريلاميد 25 خفضه. نظرًا لأن الوزن الجزيئي عنصر مهم في معامل الاحتكاك f ، يشار إلى المصطلح (z / f) على أنه نسبة الشحنة إلى الكتلة أو كثافة الشحنة. تسمح لنا هذه المعادلة أيضًا بمقارنة سلوك جزيئين مشحونين مختلفين في مجال كهربائي.
نظرًا لأن تأثير المجال الكهربائي على النوعين الجزيئيين المختلفين سيكون هو نفسه ، يجب أن يكون الاختلاف في v بسبب الاختلاف في z / f ، نسبة الشحنة إلى الكتلة للجزيئين المعنيين. يمكن إظهار هذه النقطة من خلال تحديد معلمة أخرى ، التنقل الكهربي (µ) ، السرعة لكل وحدة من المجال الكهربائي ، v E = zf ، وبالتالي ، فإن الحركة الكهربية لبروتينين مختلفين ، µ1 مقابل µ2 ، ستكون متشابهة في كهربائي مجال. يتناسب مع الفرق بين كثافة الشحنة أو نسبة الشحنة إلى الكتلة لنوعين من الجزيئات.
التنقل الكهربي (µ) ، مثل الوزن الجزيئي ، هو خاصية فيزيائية لأنواع جزيئية مختلفة.
لاحظ ، مع ذلك ، أنه على عكس الوزن الجزيئي ، فهو ليس ثابتًا فيزيائيًا ، ولكنه خاصية متغيرة تعتمد على الرقم الهيدروجيني للمحلول الذي يذوب فيه الجزيء. في حين أن طبيعة وعدد المجموعات المؤينة في جزيء ما هي سمة ثابتة لتركيبها الجزيئي ، فإن ما إذا كانت هذه المجموعات قابلة للتأين أم لا يعتمد على الرقم الهيدروجيني للمحلول.
وبالتالي ، فإن الشحنة الصافية على الجزيء z هي دالة لـ ph. القاعدة العامة هي أن z يصبح أكثر إيجابية مع انخفاض الرقم الهيدروجيني ، ويجب أن يكون فهمك العام لعملية التأين فيما يتعلق بالجزيئات العضوية بحيث يمكنك شرح سبب ذلك. يعتمد اتجاه الهجرة أيضًا على صافي الشحنة الجزيئية.
تتحرك الأنواع المشحونة إيجابياً (أي الكاتيونات) نحو القطب السالب (أي القطب السالب الشحنة) ، بينما تتحرك الأنواع السالبة الشحنة (أي الأنيونات) نحو القطب الموجب. لا تزال هناك نقطة أخيرة يجب مناقشتها: الفرق بين PAGE (الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد التقليدي) و SDS-PAGE (الرحلان الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد مع SDS في المخزن المؤقت.
أنت على دراية بالفعل بدور المنظفات مثل SDS في استخراج بروتينات الغشاء المتكاملة (انظر صفحات بيولوجيا الخلية الجزيئية لتحديث ذاكرتك). ستستخدم هذه التقنية لإذابة بروتينات غشاء خلايا الدم الحمراء في هذا التمرين. تختلف الحركات الكهربيّة بشكل كبير عن البروتينات السليمة.
ويرجع ذلك إلى أن SDS يعطل التركيب الثانوي للجزيئات ويرتبط بالعديد الببتيدات بنفس الطريقة التي يحيط بها بروتينات الغشاء المتكامل ، مما يؤدي إلى إزاحتها عن مواقعها الديناميكية الحرارية المريحة في طبقة الدهون الثنائية.
كمية SDS المرتبطة لكل وحدة وزن من البروتين ثابتة
(1.4 جم S DS لكل جم بروتين) ونتيجة لذلك ، تصبح كثافات الشحنة (أي قيم z / f) لجميع البروتينات كما هي ، ويتم إنشاء الشحنة بواسطة SDS المرتبط بدلاً من مجموعات البروتين R. في ظل هذه الظروف ، يكون التنقل الكهربي هو دالة للوزن الجزيئي بسبب خاصية المنخل الجزيئي لجيل بولي أكريلاميد.
بعبارة أخرى ، تتحرك الجزيئات الأصغر بشكل أسرع من الجزيئات الأكبر عبر مسام الهلام. عندما يتم رسم المسافة المهاجرة كدالة للوزن الجزيئي اللوغاريتمي ، يتم الحصول على خط مستقيم مثل ذلك الموضح في الشكل 2.3. وبالتالي ، لا تفصل SDS-PAGE البروتينات المختلفة في خليط فحسب ، بل توفر أيضًا تقديرًا دقيقًا لوزنها الجزيئي. = µ
الوزن الجزيئي بولي أكريلاميد الكهربائي
الهجرة كدالة للمسافة لمختلف البروتينات التي ستكون متاحة في الخلطات القياسية لهذا التمرين. احتياطات السلامة في إجراءات المختبر اليوم الأول 1. خطر! خطر التعرض لصدمة! على الرغم من أن آلة الفصل الكهربائي مزودة بباب أمان ، إلا أنه يجب دائمًا التعامل معها بحذر. يمكن أن يؤدي التلامس غير المبالي إلى صدمة كهربائية مؤلمة (ولكنها ليست قاتلة).
الأكريلاميد و bis سموم عصبية قوية
التي يتم امتصاصها بسهولة من خلال الرئتين وكذلك من خلال الجلد في شكل نقي (أي مسحوق) أو قابل للذوبان في الماء. ومع ذلك ، لن تضطر إلى التعامل مع هذه المكونات حيث سيتم سكب الجل من أجلك من قبل طاقم الإعداد. بولي أكريلاميد ليس سامًا ، ولكن نظرًا لأن بعض المونومرات غير المبلمرة قد تظل موجودة في الجل ، يجب دائمًا ارتداء القفازات المطاطية التي تستخدم لمرة واحدة عند التعامل مع الجل أو غسل الأواني الزجاجية التي تتلامس مع مادة الأكريلاميد. 3. كن حذرًا لتجنب الحروق عند استخدام حمام الماء الساخن.
الرحلان الكهربي بولي أكريلاميد PEM
27 الجزء الأول: فصل الدم إلى كسور خلوية وبلازما 1. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الذي تبلغ سعته 12 مل والذي يحتوي على 10 مل من دم الثدييات من دلو الثلج. قم بتجفيف السطح الخارجي باستخدام KimWipe وضعه في أحد دلاء جهاز طرد مركزي سريري مبرد. إذا لم تتمكن من موازنة الأنبوب الخاص بك مع أنبوب زوج آخر من الطلاب ، فقم بإعداد أنبوب موازنة مملوء بالماء لوضعه في الدلو على الجانب الآخر من دوار جهاز الطرد المركزي. 2. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. 3. باستخدام ماصة Pasteur البلاستيكية ، ارسم بعناية ماصة مليئة بالبلازما الطافية في أنبوب الاختبار. احرص على عدم تهيج الخلايا المترسبة. التسمية ر.
قم بتخزين الأنبوب في دلو الثلج
لحين الحاجة لاحقا. أزل باقي المادة الطافية باستخدام ماصة Pasteur واسكبها في حاوية نفايات بلاستيكية. 4. أضف 6 مل من المخزن المؤقت للغسيل متساوي التوتر المثلج (150 ملي كلوريد الصوديوم + 5 ملي مولار من فوسفات الصوديوم مم EDTA ، الرقم الهيدروجيني 7.4) من ماصة إلى الخلايا الحبيبية. تغطية الخلايا مع بارافيلم ودوامة بلطف لخلط بالتساوي مع غسل العازلة. 5. أضف ما يكفي من المخزن المؤقت لموازنة الأنبوب بآخر وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. 6. صب المخزن المؤقت للغسيل طاف في كوب النفايات البلاستيكية. 7. كرر الخطوة 4.
الجزء 2: عزل البروتينات الخلوية 1. ضع طرف أزرق كبير التجويف على ماصة إيبندورف 1000 ميكرولتر. رسم بعناية 1000 ميكرولتر (أي 1 مل) من الخلايا المعبأة في الطرف. 2. أعد تعليق الخلايا في 19 مل من محلول انحلال الدم منخفض التوتر المثلج (5 ملي فوسفات الصوديوم مم EDTA ، ph 8) في أنبوب طرد مركزي من البولي كربونات بسعة 50 مل يمكنك العثور عليه في دلو الثلج. إذا لزم الأمر ، اغسل الحافة عدة مرات عن طريق سحب محلول انحلال الدم بعناية من خلاله. 3. تغطية مع parafilm والدوامة بقوة. 4. قم بموازنة أنبوب الطرد المركزي الخاص بك مع أنبوب المجموعة الأخرى عن طريق إضافة بضع قطرات من محلول انحلال الدم المبرد إلى الأنبوب الأخف. تذكر أن تجفف الجزء الخارجي من أنبوب جهاز الطرد المركزي قبل الموازنة. ثم ضعه على الفور في دوار جهاز الطرد المركزي.
تدور الخلايا المتحللة عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لتكوير الأغشية.
خلال هذا الوقت ، استمر في خطوة الجزء ، وعندما يتوقف الدوار ، قم بإزالة الأنبوب برفق. تشكل الأشباح كرة فضفاضة جدًا ، لذا عليك التحكم في الأنبوب بعناية وإلا ستعيد تعليقهم. (أ) باستخدام ماصة بلاستيكية باستور ، قم بإزالة ماصة مليئة بالمواد الطافية الحمراء الساطعة من أعلى الأنبوب بعناية. انقله إلى أنبوب اختبار. سيكون هذا هو جزء البروتين السيتوبلازمي الخاص بك. قم بتسميتها Cy وتخزينها في دلو الثلج الخاص بك. (ب) بعد ذلك ، صب بعناية باقي المادة الطافية في وعاء بلاستيكي. تذكر أن تضع الرصاصة فوق الرصاصة حتى لا تسقط في البرميل وتخرج من البرميل معها
طاف الكهربائي بولي أكريلاميد
إذا قمت بذلك بنجاح ، فسيظل جزء الأشباح (G) الخاص بك كحبيبات فضفاضة في نهاية أنبوب جهاز الطرد المركزي. قد يكون من الضروري إزالة المخزن المؤقت المتبقي باستخدام ماصة باستور البلاستيكية. (ج) أضف 10 مل من المخزن المؤقت لانحلال الدم المثلج إلى الحبيبات من ماصة واخلطها برفق باستخدام ماصة باستور البلاستيكية. التوازن والدوران لمدة 10 دقائق عند 14000 دورة في الدقيقة. استنزاف المادة الطافية والحبيبات هي خصم روحك (G).
الجزء 3: تجزئة بروتينات البلازما عن طريق التمليح 1. إلى 250 ميكرولتر من كبريتات الأمونيوم المشبعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل (المسمى A) ، أضف 250 ميكرولتر من البلازما باستخدام ماصة إيبندورف 250 ميكرولتر. 2. قم بغطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق والدوامة لفترة وجيزة ولكن بشكل كامل. ثم يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. 3. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. (تأكد من موازنة الأنبوب الخاص بك مع أنبوب آخر.) عند إدخال أنبوب الطرد المركزي الدقيق في الدوار ، ضعه مع المفصلة باتجاه مركز الدوار. يسمح لك ذلك بتصريف الجزء العلوي من الحبيبات ، وبالتالي تقليل فرصة انفصال الحبيبات السائبة مع المادة الطافية.
صب بعناية المادة طافية في أنبوب اختبار مليلتر.
ضع علامة باسم وتخزينها في دلو الثلج الخاص بك. قم بتدوير ChemVip وضعه في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لإزالة المادة الطافية الأخيرة من البروتينات المترسبة عن طريق عمل الشعيرات الدموية. 5. من ماصة مكررة ، أضف 1 مل من كبريتات الأمونيوم نصف المشبعة إلى الرواسب لغسل آخر آثار المادة الطافية. أعد التعليق عن طريق الشفط المتكرر باستخدام ماصة باستور البلاستيكية. 6. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح أعلاه. صب سائل الغسيل في كوب نفايات بلاستيكي. قم بإزالة كل قطرة أخيرة باستخدام Kimwipe الملتوية. سيكون الإيداع هو كسر Ap الخاص بك. قم بتخزينه في دلو الثلج الخاص بك.
الجزء 4: تجزئة بروتينات البلازما بواسطة ترسيب الإيثانول 1. إلى 250 ميكرولتر من الإيثانول المطلق البارد في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل (المسمى E) ، أضف 500 ميكرولتر من البلازما مع ماصة إيبندورف 500 ميكرولتر.
2. قم بغطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق والدوامة لفترة وجيزة ولكن بشكل كامل. ثم احفظه في دلو الثلج لمدة 5 دقائق. 3. جهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي صغير مبرد لمدة 3 دقائق. (تأكد من موازنة الأنبوب الخاص بك مع أنبوب آخر.) قم بتسمية Es وتخزينها في دلو الثلج. قم بتدوير ChemVip وضعه في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لإزالة المادة الطافية الأخيرة من البروتينات المترسبة عن طريق عمل الشعيرات الدموية. 5. من الماصة المكررة ، أضف 1 مل من الإيثانول المبرد بنسبة 50٪ إلى الحبيبات لإزالة آخر آثار المادة الطافية. أعد التعليق عن طريق الشفط المتكرر باستخدام ماصة باستور البلاستيكية. حاول القيام بذلك بسرعة حتى لا تسخن تحضيرك بحرارة أصابعك.
15 جهاز طرد مركزي كهربائي بولي أكريلاميد مرة أخرى في جهاز طرد مركزي صغير مبرد كما هو موضح أعلاه. صب سائل الغسيل في كوب نفايات بلاستيكي. قم بإزالة كل قطرة أخيرة باستخدام Kimwipe الملتوية. سيكون الترسب جزء Ep. قم بتخزينه في دلو الثلج الخاص بك. الجزء 5: تحضير العينات لـ SDS-PAGE 1. ارفع درجة حرارة الصفيحة الساخنة حتى يغلي الماء بحلول الوقت الذي تصبح فيه العينات جاهزة. 2. من ماصة مكررة ، أضف 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (80 مم تريس ملي مولار DTT + 2٪ SDS) لكل من أربعة أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 مل.
(أ) باستخدام ماصة إيبندورف سعة 50 ميكرولتر ، أضف 50 ميكرولتر من كل من الكسور السائلة الثلاثة (بروتينات السيتوبلازم ، وطاف كبريتات الأمونيوم ، وطاف الإيثانول) إلى أنبوب مختلف للطرد المركزي. قم بتسمية Cy و As و Es. امزج بلطف عن طريق النقر على جانب الأنبوب. (ب) باستخدام ماصة إيبندورف سعة 50 ميكرولتر وطرف أصفر واسع التجويف ، أضف 50 ميكرولتر من المشروبات الروحية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. الملصق G. 3. أضف 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على كبريتات الأمونيوم ورواسب الإيثانول (Ap و Ep ، على التوالي). أغلق الأغطية ودوامة الأنبوبين حتى يتم خلط الرواسب تمامًا مع العينة العازلة. إذا كنت تواجه صعوبة في إعادة تعليق الحبيبات ، فاستخدم ماصة إيبندورف 1000 ميكرولتر (مع طرف) لتفتيت الحبيبات.
ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على رف في حمام مائي مغلي واتركه يغلي لمدة 5 دقائق.
يجب أن تلامس أطراف الأنابيب الماء المغلي فقط. اضبط الحرارة حتى لا يغلي الماء كثيرًا. 5. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من حمام الماء المغلي ، وجفف الخارج باستخدام Kimwipe ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير أي مادة غير قابلة للذوبان قد تكون قد ترسبت أثناء الغليان.
عيناتك جاهزة الآن للتحميل في آبار الهلام المناسبة. احرص على عدم تعكير صفو الرواسب قبل التحميل. الجزء 6: تحميل الجل وإجراء الرحلان الكهربائي 1. جهاز الجل الذي تستخدمه من أحدث تصميم ، وعادة ما يتم بيعه لمختبرات البحث. سيقوم طاقم التحضير بصب الجل لك وتثبيته في آلة الجل. ومع ذلك ، ستحتاج إلى التحقق من الإعداد الخاص بك لمعرفة مدى ملاءمته معًا.
(أ) حدد غطاء الأمان الذي يفتح من خلال رفعه للخلف للسماح لك بتشغيل الماكينة. ابحث عن دعامات التوصيل حيث يتم توصيل الأسلاك الكهربائية. لاحظ أنه لا يمكنك توصيل الخيوط مع فتح الغطاء ، وبالتالي لا يمكنك لصق أصابعك عن طريق الخطأ في الحمامات العازلة بعد تشغيل التيار. (ب) تمتلئ الغرف العازلة العلوية والسفلية بعازل كهربائي. في الجزء السفلي من كل غرفة توجد أقطاب من الأسلاك البلاتينية التي تنقل التيار إلى النظام. (ج) يتم وضع لوح الهلام بين لوحين زجاجيين مغلقين عموديًا في الجهاز. يتم تشغيل فواصل التفلون البيضاء عموديًا على كل حافة من اللوح. يجب إغلاق الساندويتش بإحكام في الماكينة لمنع التشريد الكهربائي
الرحلان الكهربي للحجرة العلوية بولي أكريلاميد
لا يتسرب. إذا بدا أن نظامك يتسرب ، فاتصل بمساعد التدريس. (د) لاحظ أن الألواح الزجاجية ذات ارتفاع غير متساوٍ. اللوحة الخلفية أقصر من اللوحة الأمامية ، مما يسمح للجانب الخلفي للجيل بالاتصال بمخزن الرحلان الكهربائي في الغرفة العلوية. في الجزء العلوي من الجل ، ستجد 20 عينة من الآبار.
هذا هو المكان الذي تقوم فيه بتحميل العينات الخاصة بك. بما أن الجل واضح ، فمن الصعب رؤية الآبار. باستخدام علامة ، قم بعمل خط في أسفل البئر بحيث يمكنك بسهولة تحديد موقع الآبار أثناء التحميل. 2. استخدم ماصة إيبندورف 10 ميكرولتر لتحميل الجل. يتمثل الإجراء في سحب أي مادة سيتم تحميلها على طرف إيبندورف ، وإدخال الطرف أسفل سطح محلول الرحلان الكهربائي بين الألواح الزجاجية وأعلى البئر الذي تريد وضع العينة فيه ، ثم اضغط برفق على الزر زر. ، يستنزف العينة في البئر.
نظرًا لأن المخزن المؤقت للعينة يحتوي على 10 ٪ من الجلسرين ، فسيكون أكثر كثافة من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ويمكنك رؤية العينة تسقط من خلال المخزن المؤقت الكهربائي إلى قاع البئر. (أ) سيكون لديك ست عينات وثلاثة معايير للتحميل. اتبع بروتوكول التحميل الوارد في قسم البيانات. ضع علامة على الترتيب على قطعة من الشريط أسفل الآبار مباشرة. تأكد من عدم تحميل عينتين في نفس البئر.
لاحظ أنه يتم ترك بئر واحدة فارغة على الجانب الأيسر من الجل وبئرين على اليمين حتى تتمكن من معرفة أي جانب هو ما إذا تم قلب الجل أثناء خطوات التلوين والتقطيع. (ب) تحميل 10 ميكرولتر من مستحضرات البلازما (As و Ap و Es و Ep) والمعايير. تحميل 20 ميكرولتر من مستحضرات خلايا الدم الحمراء ، G و C. 3. أغلق غطاء علبة الهلام وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية. تم وضع علامة على موقع القرائن الحمراء والسوداء على المربع.
4. أدر المضخم بالكامل في اتجاه عقارب الساعة واضبط الجهد على 200. في هذا الإعداد ، سيستغرق تشغيل الجل حوالي 4 ساعات. 5. انتبه إلى رقم الكود الموجود على علبة الجل. سجل هذا الرقم في قسم البيانات الخاصة بك. يسمح لك بتحديد الجل بعد التلطيخ والتلطيخ. الجزء 7: تلطيخ وإزالة الجل (سيتم تنفيذ هذه الإجراءات من أجلك بواسطة أفراد التحضير) 1. عندما تصل صبغة التتبع إلى حوالي 2 سم من قاع الجل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وفصل الأقطاب الكهربائية.
2. ارتدِ زوجًا من القفازات المطاطية (تتوفر أحجام صغيرة ومتوسطة وكبيرة). 3. احمل علبة الجل إلى الحوض بحيث يكون الجزء الخلفي مواجهًا لك. افتح غطاء الأمان وقم بإفراغ المخزن المؤقت من الجزأين العلوي والسفلي داخل الحوض. 4. عد إلى مكتبك ، وقم بفك مشابك الجل عن طريق تدوير المقابض السوداء ، ثم قم بإزالة شطيرة الهلام من الصندوق. 5. ضع الشطيرة على ورق معمل ماص مع الجانب الأقصر في الأعلى. حرك الفاصل على طول إحدى الحواف للخارج بين الألواح الزجاجية. ثم اقلبها بحيث ترفع اللوحة العلوية عن الجل. يجب عليك استخدام قوة كبيرة ، لأن اللوحة تلتصق بشدة بالجل. عندما يكون الزنبرك مفكوكًا ، ضع كل من اللوح العلوي والمباعد في وعاء نظيف مملوء بالماء والصابون. ثم خذ الفاصل الثاني وضعه داخل الحاوية.
رحلان بولي أكريلاميد الكهربائي بأصابعك
قم بفك لوح الهلام بعناية من اللوحة السفلية وانقله إلى صندوق تلوين جل بلاستيكي مملوء مسبقًا بمحلول Coomassie Brilliant Blue R حتى عمق 2 سم. ضع صندوق تلوين الجل الخاص بك وضعه على الطاولة المتذبذبة. 8. بعد ساعة واحدة ، صب البقعة في حاوية البقع المستخدمة (لإعادة استخدامها). أضف محلول التلوين رقم 1 إلى عمق 2 سم وأعد الصندوق إلى طاولة الاهتزاز. يمكن تقصير هذه العملية بشكل كبير عن طريق إزالة البقع الزائدة من المحلول. يمكن القيام بذلك عن طريق أخذ 4 أو 5 مناديل Kimwipes ووضعها في محلول مزيل الشحوم.
(أ) بعد فترة 3-4 ساعات ، قم بإزالة صندوق التلوين من طاولة الاهتزاز ، وصب محلول التلوين في الحوض بالماء البارد ، واستبدله بمحلول جديد ، وأعده إلى طاولة الاهتزاز. (ب) يجب أن تكرر الخطوة المذكورة أعلاه مرتين أو ثلاث مرات ليصبح المجموع من ثلاث إلى أربع دفعات من محلول إزالة اللون. عادة ما يكون من الأسهل تركها تجف بين عشية وضحاها. 9. في صباح اليوم التالي ، تقوم بنقل الجل إلى محلول التلوين رقم 2. يحتوي محلول الغبار رقم 1 على نسبة عالية من الميثانول ويتقلص الجل إلى حد كبير.
يحتوي محلول الغبار رقم 2 على نسبة صغيرة من الميثانول ويعود الجل إلى حجمه الأصلي. 10. بمجرد أن يتلطخ الجل بشكل كافٍ ، قم بلفه بقطعة من السيلوفان حتى تتمكن من التعامل معه بسهولة للتقييم. اليوم الثاني من إجراءات المختبر إذا لم تكن تقوم بالرسم وتلطيخ نفسك ، امنح فريق الإعداد يومين يومين لإكمال الإجراء. فحص الجل الملطخ 1. سوف تجد الجل الخاص بك مع نسخة زيروكس من الجل في الغرفة 104 Cresp Labs. ينتج Xerography نسخة جيدة إلى حد ما من الجل ، على الرغم من أن بعض الأشرطة الفاتحة قد تكون مفقودة وقد تظهر النطاقات الداكنة المتقاربة كأنها واحدة. 2. ضع جل السيلوفان الملون الخاص بك على صندوق الضوء. سيحدد الشريط الأبيض الموجود أعلى الهلام العينة في كل بئر.
قارن الجل الخاص بك بآلة تصوير زيروكس
وفي الجزء الثاني ، أظهر المكونات الثانوية شديدة السطوع بالنسبة لآلة التصوير والنطاقات المظلمة العريضة التي تمثل في الواقع شريطين داكنين متقاربين. 4. استخدم مسطرة مليمتر بلاستيكية لقياس المسافة التي يقطعها كل مكون. سجل هذه القيم في الجدول في قسم البيانات. قم بالقياس من أسفل البئر إلى منتصف كل شريط. لاحظ أيضًا الكثافة النسبية لكل نطاق (مظلمة جدًا ، ومظلمة ، وخفيفة ، وخفيفة جدًا هي فئات مقترحة).
بولي أكريلاميد الكهربائي
5. الهوية والوزن الجزيئي (من حيث كيلو دالتون) للمكونات في الخليط القياسي هي: S1: ألبومين مصل البقر … 66 ألبومين بيض … 45 نازع هيدروجين غليسرالديهيد -3 فوسفات … 36 أنهيدراز كربوني. ..29 التربسينوجين … 24 مثبط التربسين بفول الصويا … 20 ألفا لاكتالبومين … 14 S2: ميوسين بيتا جالاكتوزيداز فسفوريلاز … ألبومين المصل البقري 97 … ألبومين البيض 66 … 45 أنهيدراز الكربونيك … 29 S3: ألبومين المصل البقري … 66 ملاحظة: تستخدم هذه البروتينات كمعايير فقط وتشير بالضرورة إلى أنها ليست مانحة لأي من العناصر المجهولة في أجزاءك. تقرير المختبر
لخص المسافة التي يقطعها كل مكون في المعايير وكل عينة في شكل جدول.
2. باستخدام ورق الرسم البياني شبه اللوغاريتمي ، ارسم الوزن الجزيئي للمعايير (بالكيلودين على مقياس لوغاريتمي) مقابل المسافة المقطوعة (سم ، على مقياس خطي). يجب أن يبدو الرسم البياني الخاص بك مثل الشكل 2.3. (أ) ارسم خطًا أفضل ملاءمة للجزء الخطي من الرسم البياني. إذا لم تكن القيم القصوى في الصف ، فقم بتمديد البند عن طريق الفحص. (ب) باستخدام هذا المنحنى القياسي ، قم بتقدير الوزن الجزيئي لمكونات عيناتك الست. نظرًا لأن المكونات الرئيسية والثانوية للمعايير قد لا تكمن في المنحنى ، قم بتقدير الوزن الجزيئي للمكونات الرئيسية والثانوية في عيناتك عن طريق الفحص. سجل هذه القيم في الجدول الخاص بك.
3. استخدام هذه البيانات (على سبيل المثال ، الحجم الجزيئي والوفرة الجزيئية والجزء الذي يوجد فيه النطاق) جنبًا إلى جنب مع المعلومات الواردة في قسم الخلفية لهذا التمرين وفي كتبك المدرسية ، حول تخمين هوية المكونات المختلفة في كل واحدة. 4. فيما يتعلق بـ (أ) الأداء المقارن لطريقتين للترسيب الجزئي ، (ب) الوجود غير المتوقع أو عدم وجود مكونات مختلفة في كل عينة ، و (ج) النقاط الأخرى التي أشار إليها مساعد التدريس ، استخلص النتائج 5. يجب تضمين قسم البيانات في تقريرك.