3.1 غلظت ژل آگارز درصد آگارز مورد استفاده به اندازه قطعاتی که باید جدا شوند بستگی دارد. غلظت آگارز به عنوان درصد آگارز به حجم بافر (w/v) نامیده می شود و ژل آگارز معمولاً در محدوده 0.2٪ تا 3٪ است (اسمیت، 1993). هرچه غلظت آگارز کمتر باشد، قطعات DNA سریعتر مهاجرت می کنند. به طور کلی، اگر هدف جداسازی قطعات بزرگ DNA باشد، باید از غلظت کم آگارز غلظت ژل پلی اکریل آمید ( PAM ) استفاده کرد و اگر هدف جداسازی قطعات کوچک DNA باشد، غلظت بالای آگارز توصیه می شود (جدول 3). غلظت آگارز (%) محدوده اندازه DNA (bp) جدول 3. غلظت ژل آگارز برای حل مولکول های DNA خطی. 3.2 غلظت ژل پلی آکریل آمید انتخاب غلظت آکریل آمید برای جداسازی بهینه غلظت ژل پلی اکریل آمید ( PAM ) مولکول ها حیاتی است (Hames, 1998). با انتخاب غلظت مناسب از آکریل آمید و عامل اتصال عرضی متیلن بیساکریل آمید، اندازه منافذ ژل قابل کنترل است. با افزایش درصد کل غلظت (T) مونومر (اکریلامید به علاوه پیوند متقابل) در ژل
اصول و مبانی الکتروفورز غلظت ژل پلی اکریل آمید ( PAM )
ژل اندازه منافذ در یک رابطه تقریبا خطی کاهش می یابد. ژل های درصد بالاتر (T بالاتر)، با منافذ کوچکتر، برای جداسازی مولکول های کوچکتر استفاده می شوند. رابطه درصد مونومر کل نشان داده شده توسط پیوند متقابل (C) پیچیده تر است. محققان بر روی مقادیر C 5٪ (19:1 آکریل آمید/بیساکریل آمید) برای اکثر اشکال الکتروفورز DNA و RNA دناتوره کننده و 3.3٪ (29:1) برای اکثر پروتئین ها، DNA بومی و ژل های RNA استقرار یافته اند. برای بهینه سازی می توان از ژل های پلی آکریل آمید 5 تا 10 درصد با اتصال عرضی متغیر از 1 تا 5 درصد استفاده کرد. پیوند متقابل کم (زیر 3٪ C) ژل های فیبر بلند با افزایش اندازه منافذ را ایجاد می کند (Glavač & Dean, 1996).
علاوه بر این، غلظت ژل پلی اکریل آمید ( PAM ) لازم به ذکر است که
در غلظت های پایین آکریل آمید/بیساکریل آمید، کار با ژل ها دشوار است زیرا لزج و نازک هستند. جدول 4 نسبت های توصیه شده آکریل آمید/بیساکریل آمید و درصد ژل را برای محدوده های مختلف اندازه مولکولی نشان می دهد. ژل نسبت آکریل آمید/بیس % DNA/RNA بومی (bp) DNA/RNA دناتوره شده (bp) 19: : <40 <40 جدول 4. غلظت ژل پلی آکریل آمید برای حل مولکول های DNA/RNA. توجه: برنامه های کاربردی توصیه شده برای هر فرمول به صورت پررنگ نشان داده شده است.