یک روش رنگ آمیزی سبز DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بر اساس نانوخوشه های مس فلورسنت سنتز شده درجا

Nano Research DOI /sy Nano Res 1 یک روش رنگ آمیزی سبز DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بر اساس نانوخوشه های مس فلورسنت سنتز شده درجا Xiaoli Zhu 1، Hai Shi 1، Yalan Shen 1، Bin Zhang 1، Jing Zhao 1 و Genxi Li1. ,2 ( ) Nano Res., Just Accepted Manuscript DOI /sy در 8 آوریل 2015 انتشارات دانشگاه Tsinghua 2015 Just Accepted این یک نسخه خطی فقط پذیرفته شده است که توسط فرآیند بررسی همتا مورد بررسی قرار گرفته و برای انتشار پذیرفته شده است. یک نسخه خطی Just Accepted بلافاصله پس از پذیرش به صورت آنلاین منتشر می شود که قبل از ویرایش فنی و قالب بندی و تصحیح نویسنده است. انتشارات دانشگاه Tsinghua (TUP) Just Accepted را به عنوان یک سرویس اختیاری و رایگان ارائه می دهد که به نویسندگان اجازه می دهد نتایج خود را در اسرع وقت پس از پذیرش در دسترس جامعه تحقیقاتی قرار دهند. پس از ویرایش فنی و قالب‌بندی یک دست‌نوشته، از وب‌سایت Just پلی اکریل آمید ( PAM ) Accepted حذف می‌شود و به‌عنوان یک مقاله ASAP منتشر می‌شود. لطفاً توجه داشته باشید که ویرایش فنی ممکن است تغییرات جزئی در متن دست‌نوشته و/یا گرافیک ایجاد کند که ممکن است بر محتوا تأثیر بگذارد و تمام سلب مسئولیت‌های قانونی که در مورد مجله اعمال می‌شود مربوط می‌شود. به هیچ وجه TUP مسئول خطاها یا عواقب ناشی از استفاده از هر گونه اطلاعات موجود در این دست نوشته های Just Accepted نیست. برای استناد به این دست‌نوشته لطفاً از شناسه دیجیتال شی (DOI) آن استفاده کنید، که برای همه قالب‌های انتشار یکسان است.

2 فهرست مطالب (TOC) روش رنگ آمیزی سبز DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بر اساس نانوخوشه های مس فلورسنت سنتز شده درجا Xiaoli Zhu 1, Hai Shi 1, Yalan Shen 1, Bin Zhang 1, Jing Zhao 1, and Genxi Li . 2* 1 آزمایشگاه فناوری حسگر زیستی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه شانگهای، شانگهای، روابط عمومی چین. 2 آزمایشگاه کلیدی دولتی بیوتکنولوژی دارویی، گروه بیوشیمی، دانشگاه نانجینگ، نانجینگ، PR چین. رنگ آمیزی سبز DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بر اساس نانوخوشه های مس فلورسنت سنتز شده در محل به دست می آید. این یک جایگزین امیدوارکننده برای روش‌های رنگ‌آمیزی ناایمن است.

3 DOI تحقیقاتی نانو (به طور خودکار توسط ناشر درج می شود) مقاله تحقیقاتی روش رنگ آمیزی سبز DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بر اساس نانوخوشه های مس فلورسنت سنتز شده درجا Xiaoli Zhu 1, Hai Shi 1, Yalan Shen 1, Bin Zhang 1, Jing Zhao1 . و Genxi Li 1,2 ( ) دریافت شد: روز ماه سال تجدید نظر: روز ماه سال پذیرش: روز ماه سال (به طور خودکار توسط ناشر درج شد) انتشارات دانشگاه Tsinghua و Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014 کلمات کلیدی رنگ آمیزی، اسیدهای نوکلئیک، ژل پلی آکریل آمید، نانو خوشه‌های مس، الکتروفورز چکیده ایمنی رنگ‌های رنگ‌آمیزی اسیدهای نوکلئیک مدت‌هاست که محققان را آزار می‌دهد. تلاش‌های گسترده‌ای برای جستجوی جایگزین‌هایی برای محبوب‌ترین اما سمی‌ترین رنگ رنگ‌آمیزی، یعنی اتیدیوم بروماید (EtBr) انجام شده است. با این حال، هیچ روش رنگ آمیزی را نمی توان تضمین کرد که به اندازه کافی ایمن است.

در این مقاله، ما یک روش رنگ آمیزی پلی اکریل آمید ( PAM ) سبز DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید را گزارش می کنیم،

که در آن سنتز درجا نانوخوشه های مس فلورسنت با الگوی DNA (CuNCs) در ژل به دست می آید تا نوارهای DNA در زیر نور UV قابل مشاهده باشد. علاوه بر این، عملکردهای جامعی از این روش رنگ‌آمیزی انجام شده و نتایج تجربی نشان می‌دهد که از حساسیت، پایداری و قابلیت استفاده مطلوبی برخوردار است. در همین حال، در آزمایشات حیوانی ما، دو معرف (سولفات مس و اسید اسکوربیک) و همچنین CuNC های سنتز شده ثابت شده است که در تماس با پوست غیر سمی هستند. علاوه بر این، تمام معرف‌های مورد استفاده در این کار به آسانی در پلی اکریل آمید ( PAM ) دسترس و مقرون به صرفه هستند و روش این روش نسبتاً ساده است. بنابراین، این روش رنگ‌آمیزی جدید با سنتز درجا CuNC‌های فلورسنت با الگوی DNA ممکن است چشم‌اندازهای کاربردی زیادی در آینده داشته باشد. ژل الکتروفورز DNA یک تکنیک تحلیلی شناخته شده است که برای جداسازی، خالص سازی و شناسایی قطعات DNA استفاده می شود. این به یکی از مهم ترین تکنیک ها در علم زندگی مدرن تبدیل شده است و به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی [1]، ژنتیک [2]، میکروبیولوژی [3]، بیوشیمی [4] و پزشکی قانونی [5] استفاده شده است. از آنجایی که مولکول های DNA بی رنگ هستند، بنابراین پیشرفت آنها از طریق ژل در طول الکتروفورز قابل پیگیری نیست مگر اینکه یک روش رنگ آمیزی انجام شود. در سال 1972، اتیدیوم بروماید (EtBr)، رایج ترین رنگ، برای اولین بار به عنوان برچسب DNA در الکتروفورز ژل مورد استفاده قرار گرفت [6]. می تواند در شیار اصلی DNA وارد شود و تحت نور UV فلورسانس کند تا نوارهای DNA قابل مشاهده باشد. با این حال، به دلیل جهش زایی بالقوه انسانی و مکاتبات پیچیده آدرس به Genxi Li، genxili@nju.edu.cn.

4 2 Nano Res. مسائل مربوط به دفع زباله های EtBr، محققان به طور مداوم به دنبال روش های رنگ آمیزی جایگزین بوده اند. در حال حاضر، رنگ‌های SYBR که توسط SYBR Green I ارائه می‌شوند، به محبوب‌ترین جایگزین برای EtBr تبدیل شده‌اند. SYBR Green I، یک رنگ سیانین نامتقارن، گزارش شده است که 25 برابر حساس تر و احتمالاً ایمن تر از EtBr است [7]. با این وجود، ایمنی SYBR Green I و همچنین برخی دیگر از لکه‌های نوظهور تضمین شده نیست، زیرا نتایج مخالفی نیز برای نشان دادن سمیت آنها وجود دارد، و هیچ داده‌ای در مورد جهش‌زایی یا سمیت آنها در انسان وجود ندارد [8]. علاوه بر این، علیرغم مزیت عملکردی برخی از جایگزین ها برای اهداف رنگ آمیزی، بسیاری از محققان همچنان EtBr را ترجیح می دهند زیرا به طور قابل توجهی ارزان تر است. بنابراین، یک روش رنگ آمیزی با ایمنی مطلوب و کارآمدی هزینه هنوز به شدت مورد نیاز است. اخیراً، نانوخوشه‌های فلزی (MNCs)، نوع جدیدی از نانومواد فلورسنت، توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند [9-13].

سنتز MNC های فلورسنت با الگوی زیست مولکول، پلی اکریل آمید ( PAM ) مفهومی را برای پیوند مولکول های زیستی با نانو برچسب ها به روشی طبیعی ارائه می دهد.

DNA از دیرباز به عنوان یک الگوی خوب در سنتز نانومواد شناخته شده است [14-17]. سنتز الگوی DNA از نانوخوشه‌های مس فلورسنت (CuNCs)، نانوخوشه‌های نقره (AgNCs) و نانوخوشه‌های طلا (AuNCs) نیز به‌طور متوالی در سال‌های اخیر گزارش شده است [18-20]. برای مثال با در نظر گرفتن CuNC ها، گزارش شده است که DNA متصل به سطح سیلیکون را می توان با مس متالیز کرد [21]. بر این اساس، گروه موخیر دریافتند که DNA دو رشته ای (dsdna) می تواند به عنوان الگویی برای سنتز CuNC های فلورسنت در محلول عمل کند [18]. از آن زمان، DNA تک رشته ای غنی از تیمین (ssdna) نیز برای کار کردن یک الگو مورد سوء استفاده قرار گرفت [22، 23]. و استفاده از CuNCهای فلورسنت با الگوی DNA در سنجش زیستی به دست آمده است [24-26]. در اینجا، با الهام از نیاز به روش رنگ‌آمیزی در الکتروفورز و پیشرفت در سنتز MNC‌های مبتنی بر DNA، یک روش جدید رنگ‌آمیزی DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید را با سنتز درجا CuNC‌های پلی اکریل آمید ( PAM ) فلورسنت در ژل ایجاد می‌کنیم. یک پروتکل آزمایشی ساده برای رنگ‌آمیزی پس از آزمایش‌های گسترده ایجاد می‌شود. عوامل درگیر رایج و ارزان هستند و ثابت شده است که در تماس با پوست غیر سمی هستند. بنابراین، این روش رنگ‌آمیزی ایمنی و کارایی مناسبی را فراهم می‌کند و ممکن است پس از بهینه‌سازی بیشتر کاربردهای بالقوه‌ای داشته باشد. شرایط تجربی برای سنتز CuNC های فلورسنت با الگوی DNA ابتدا بهینه شده است. از آنجایی که شدت فلورسانس برای رنگ آمیزی بسیار مهم است، به عنوان معیار اصلی برای قضاوت در مورد مناسب بودن شرایط عمل می کند. همچنین به دلیل وجود عوامل بسیار زیادی که ممکن است بر شدت فلورسانس رنگ‌آمیزی مبتنی بر CuNC تأثیر بگذارد و بهینه‌سازی در ژل (از جمله تهیه ژل، الکتروفورز و رنگ‌آمیزی) کاری طاقت‌فرسا با راندمان بسیار کم است، برخی آزمایش‌های رایج ممکن است. شرایط ابتدا در راه حل بهینه سازی شد تا فرآیند تسهیل شود. یک dsdna (dsdna30/40، توالی‌های نشان‌داده‌شده در مواد تکمیلی الکترونیکی (ESM))، که ثابت شده است می‌تواند به‌عنوان الگوی سنتز CuNC‌های فلورسنت کار کند، در اینجا برای بهینه‌سازی شرایط استفاده می‌شود. چندین عنصر از جمله ph، محلول بافر، قدرت یون و دما در نظر گرفته شده است.

از نتایج تجربی، شدیدترین فلورسانس در بافر MOPS (10 میلی‌متر MOPS، ph 7.5، 50 میلی‌متر MgCl2) در دمای 25 درجه سانتیگراد به دست می‌آید (شکل S1~S4 در ESM).

تحت این شرایط، CuNC های سنتز شده بلافاصله پس از اختلاط واکنش دهنده ها (CuSO4 و اسید اسکوربیک) با dsdna فلورسانس می شوند. شدت فلورسانس پس از حدود 10 دقیقه به یک فلات می رسد. پیک های تحریک و انتشار به ترتیب 343 نانومتر و 584 نانومتر هستند که نمایانگر رنگ نارنجی-قرمز در ظاهر زیر نور UV است (شکل S5 و شکل S6 در ESM). نتایج طیف‌سنجی UV-vis نشان می‌دهد که دوره تشکیل CuNCs (شامل روی الگوی DNA و بدون الگو) 80 تا 160 دقیقه طول می‌کشد (زمان لازم برای اجازه دادن به پیک جذب CuNCs به یک فلات) (شکل S7). ~S10 در ESM). از آنجایی که فقط CuNC های دارای الگوی DNA فلورسانس می شوند و شدت فلورسانس تنها در حدود 10 دقیقه می تواند به فلات برسد، منطقی است که CuNC ها اولویت تشکیل روی DNA داشته باشند و پس از آن به آهستگی بدون الگو تشکیل شوند. نتیجه رنگ آمیزی ژل تا حدی تایید کرده است که شرایط بهینه برای محلول را می توان برای ژل نیز اعمال کرد (شکل S11 در ESM). بنابراین، آن شرایط تجربی رایج، به عنوان مثال، ph، محلول بافر، قدرت یون، و دما، بدون بهینه سازی بیشتر به تصویب رسید. با این وجود، عوامل زیادی به عنوان مثال

انتشار یون‌های مس و اسید اسکوربیک در ژل، وضعیت محدود DNA در ژل، و مورفولوژی متخلخل ژل باید در نظر گرفته شود. بنابراین، آزمایش‌های گسترده‌ای بر روی زمان رنگ‌آمیزی، توالی افزودن واکنش‌دهنده‌ها، تعداد دفعات رنگ‌آمیزی و غیره انجام شده است پلی اکریل آمید ( PAM ) (شکل 1، برخی از شکل 1 که اهمیت کمتری دارند، نوارهای نشانگر DNA II (0.5 میکروگرم) در ژل پلی آکریل آمید رنگ آمیزی شده توسط CuNCs (فقط 25، 50، 75، 100 جفت باز در سمت چپ شکل 1 برای جلوگیری از شلوغی نشان داده شده است) زمان رنگ آمیزی، ترتیب افزودن واکنش دهنده ها و تعداد دفعات رنگ آمیزی برای به دست آوردن یک بهینه سازی متغیر بود. ستون‌های A، B و C به ترتیب مربوط به افزودن CuSO4 همراه با افزودن اسید اسکوربیک به محلول رنگ‌آمیزی غوطه‌ور در ژل، قبل از (15 دقیقه قبل) و بعد از (15 دقیقه بعد) هستند. و 2 تعداد دفعات رنگ آمیزی یعنی رنگ آمیزی یک و دو بار را نشان می دهد اعداد سمت چپ زمان واکنش CuSO4 با اسید اسکوربیک در یک چرخه رنگ آمیزی را نشان می دهد کادر قرمز نوارها را در شرایط بهینه نشان می دهد. در مقایسه، نوارهایی با استفاده از رنگ‌آمیزی EtBr نیز وجود دارد نشان داده نشده است). نشانگر DNA II با طول‌های مختلف قطعات DNA از 25 جفت باز تا 700 جفت باز به عنوان مدلی برای تأیید عملکرد رنگ‌آمیزی CuNCs (فقط 25، 50، 75، 100 جفت باز در سمت چپ شکل 1 نشان داده شده است تا از بودن آن جلوگیری شود. پر ازدحام). جالب است که اگر ژل بعد از الکتروفورز برای مدت معینی در سیستم واکنش غوطه ور شود و بلافاصله برای تصویربرداری خارج شود، روشنایی باندها ضعیف است. در مقابل، اگر ژل دو بار رنگ آمیزی شود، یعنی در دو سیستم واکنش مساوی اما مستقل به طور متوالی برای یک دوره معین غوطه ور شود، نوارها شفاف می شوند. تکرار بیشتر رنگ‌آمیزی تأثیر کمی بر بهبود روشنایی یا تعریف دارد، بنابراین رنگ‌آمیزی دو بار به عنوان یک فرآیند استاندارد برای آزمایش‌های زیر تنظیم می‌شود. نتایج همچنین نشان می‌دهد که عملکرد رنگ‌آمیزی CuNCs با زمان رنگ‌آمیزی و توالی افزودن واکنش‌دهنده‌ها مرتبط است. با در نظر گرفتن همه فاکتورها، شرایط بهینه نتیجه الگوی ژل مربوطه، که در کادر قرمز (شکل 1) مشخص شده است، در نهایت پذیرفته می شود. تحت این شرایط بهینه، همه باندها به وضوح قابل مشاهده هستند که ممکن است با عملکرد رنگ‌آمیزی EtBr رقابت کنند. فرآیندهای دقیق در بخش‌های تجربی و شرح شکل 1 نشان داده شده است. سپس عملکرد جامع شامل حساسیت، پایداری و قابلیت استفاده رنگ‌آمیزی CuNCs مورد مطالعه قرار می‌گیرد. همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، مقادیر مختلفی از نشانگر DNA II بارگذاری شده، الکتروفورز شده و برای بررسی حساسیت رنگ آمیزی می شود.

مشاهده می شود که روشنایی باندهای DNA با کاهش مقدار نشانگر DNA از بین می رود.

همه باندها به جز قطعه 25 جفت باز به وضوح قابل مشاهده هستند تا زمانی که مقدار مولی نشانگر DNA به 0.02 میکروگرم کاهش یابد. حساسیت مشابهی به دست می آید در حالی که رنگ آمیزی EtBr به جای آن اتخاذ می شود (شکل S12 در ESM). اگر قطعه 25 جفت باز در نظر گرفته شود، حساسیت رنگ‌آمیزی CuNCs به حدود 0.3 میکروگرم کاهش می‌یابد. گزارش شده است که فلورسانس CuNC ها به توالی و طول الگوی DNA بستگی دارد [18، 22، 23]، بنابراین در اینجا قطعه DNA کوتاه ممکن است به خوبی یک قطعه طولانی تر برای کارکرد الگو نباشد. با این وجود، عملکرد CuNC های رنگ آمیزی روی حساسیت، تحقیقات نانویی است

6 4 Nano Res. قابل قبول ما در مرحله بعد پایداری CuNC ها را بررسی می کنیم شکل 2 نردبان نشانگر DNA II با مقادیر مولی متفاوت در ژل پلی آکریل آمید با استفاده از رنگ آمیزی مبتنی بر CuNC در شرایط بهینه. شکل 3 ژل در (الف) یک محیط تاریک و آرگون، (ب) یک محیط تاریک و جوی، (ج) یک نور UV و محیط آرگون، (D) یک نور UV و محیط جو، (E) یک محیط تاریک قرار گرفت. و محیط نیتروژن، (F) محلول تاریک و اسید اسکوربیک (AA) (2 میلی متر)، برای زمان های مختلف قبل از عکاسی در زیر نور UV. اعداد بالای هر عکس زمان (دقیقه) را نشان می دهند. رنگآمیزی. در آزمایش‌ها، ژل رنگ‌آمیزی CuNCs برای مدت معینی در محیط‌های مختلف قبل از عکاسی در زیر نور ماوراء بنفش قرار می‌گیرد تا به ترتیب پایداری زمانی، هوا و عکس را مطالعه کند. همانطور که در شکل 3A نشان داده شده است، فلورسانس باندهای رنگ آمیزی شده با CuNCs به سختی در محیط تاریک و آرگون تغییر می کند، که نشان می دهد CuNC های الگوی DNA به نحوی پایدار هستند و خود پوسیدگی وجود ندارد. با این حال، توجه شده است که اگر ژل در معرض هوا قرار گیرد (شکل 3B)، فلورسانس به تدریج در 15 دقیقه ناپدید می شود. این نتیجه منطقی است، زیرا مس به‌ویژه در مقیاس نانو به راحتی توسط اکسیژن اکسید می‌شود [27]. در حالی که ژل را برای مدت معینی در معرض نور ماوراء بنفش قرار می دهیم (شکل 3C)، مشاهده می کنیم که فلورسانس نیز کمی فروپاشی دارد. با این وجود، این روند در مقایسه با اثر هوا بسیار کندتر است. این پدیده به اثر سفید کننده جهانی نور نسبت داده می شود [28]. اثر دوگانه تابش اشعه ماوراء بنفش و اکسیداسیون هوا باعث می شود باندها سریعتر از بین بروند (شکل 3D). با توجه به اینکه حفاظت از آرگون راحت نیست، نتایج نشان می دهد که محلول نیتروژن و اسید اسکوربیک نیز می تواند ژل را از اکسید شدن توسط اکسیژن محافظت کند (شکل 3E و 3F). با توجه به نتایج فوق، پیشنهاد می شود که تصویربرداری ژل بلافاصله پس از رنگ آمیزی انجام شود تا از اکسیداسیون CuNC ها جلوگیری شود. در غیر این صورت، ژل ترجیح داده می شود در محلول اسید اسکوربیک یا محیطی بدون اکسیژن در صورت نیاز به تعویق افتادن یا مشاهده مکرر نگهداری شود. که در

7 5 علاوه بر این، مانند سایر رنگ‌ها، ژل آغشته به CuNCs بهتر است برای مدت طولانی در معرض نور به ویژه نور UV قرار نگیرد. علیرغم ناپایداری CuNC ها در زیر هوا، محافظت فقط در صورتی لازم است که ژل برای مشاهده مکرر ذخیره شود. در بیشتر مواردی که از یک ژل فقط برای یک بار عکس گرفته می شود، مرحله حفاظت را می توان نادیده گرفت. در واقع، به جز ژل های نشان داده شده در شکل 3، هیچ حفاظتی برای تمام آزمایشات دیگر اتخاذ نشده است. قابلیت استفاده از رنگ‌آمیزی CuNCs با استفاده از قطعات مختلف DNA متفاوت از توالی‌های هسته ژن‌های هترولوگ (HIV، HBV، و Hly)، توالی الگوی شناخته شده (dsdna30/40)، توالی تصادفی (dsdna21)، توالی‌هایی با ساختار خاص (گیره مو، و ساختار موچین)، هیبریداسیون DNA-RNA، و محصولات تقویت DNA (HCR). توالی دقیق این نمونه ها در اطلاعات پشتیبانی (جدول S1 در ESM) نشان داده شده است. پلی اکریل آمید ( PAM ) نتایج نشان می‌دهد که تمام نمونه‌های DNA می‌توانند به خوبی توسط CuNC‌های فلورسنت سنتز شده در محل به خوبی رنگ‌آمیزی شوند (شکل 4). با این حال، آن را شکل 4 فلورسانس نمونه های مختلف رنگ آمیزی شده توسط CuNCs (چپ) و EtBr (راست) در ژل پلی آکریل آمید (بالا) و محلول (وسط)، به ترتیب. از خط 1 تا 9: dsdna21، dsdna30/40، HIV42، Hly44، HBV30، ساختار موچین، محصولات HCR، ساختار سنجاق سر، و هیبریداسیون DNA-RNA. عدد زیرمجموعه تعداد پایه ها/جفت های پایه را نشان می دهد. غلظت تمام اسیدهای نوکلئیک در 0.5 میکرومتر ثابت است. تصویر شماتیک موچین، HCR و سنجاق سر در خط 6-8 نیز در پایین ارائه شده است.

لازم به ذکر است که در برخی موارد حساسیت رنگ‌آمیزی CuNCs پلی اکریل آمید ( PAM ) به خوبی رنگ‌آمیزی EtBr نیست.

گزارش‌های قبلی و مطالعه بیشتر ما تأیید می‌کنند که توالی‌های DNA بر فلورسانس CuNCs هم در محلول [22، 23] و هم در ژل تأثیر دارند (شکل S13 در ESM). بنابراین، از آنجایی که مقادیر مولی نمونه‌های DNA یکسان است، تفاوت‌های روشنایی نوارهای رنگ‌آمیزی شده با CuNCs باید به تنوع توالی نسبت داده شود. همچنین توجه شده است که فلورسانس در ژل همیشه با محلول مطابقت ندارد. به عنوان مثال، یک دنباله تصادفی با 21 جفت باز، روشن ترین نوار را در ژل نشان می دهد (خط 1)، در حالی که در محلول، شدت فلورسانس مربوطه در سطح متوسط ​​است. مطالعه بیشتر نشان می دهد که poly(t) می تواند به عنوان یک الگو برای سنتز CuNC های فلورسنت در محلول کار کند، در حالی که هیچ باند مربوطه را نمی توان در ژل مشاهده کرد. در مورد poly(a)، پدیده فقط برعکس است (شکل S13). دلیل این اختلاف هنوز بررسی نشده است. در نهایت، تست سمیت پوستی رنگ‌آمیزی CuNCs در موش‌های پلی اکریل آمید ( PAM ) صحرایی انجام شد. دو معرف برای سنتز CuNCs (سولفات مس و اسید اسکوربیک) در تماس با پوست غیر سمی هستند. سولفات مس یک میکروب کش است، در حالی که اسید اسکوربیک همچنین به عنوان ویتامین C شناخته می شود حتی برای بدن انسان مفید است. این دو معرف همچنین غیرسمی بودن آنها در تست سمیت پوستی ما تایید شده است (شکل S14 در ESM). علاوه بر این، یا CuNC های سنتز کننده یا CuNC های سنتز شده بر روی پوست در معرض دید موش ها پخش شده اند. در مورد CuNC های سنتز کننده، سولفات مس و اسید اسکوربیک پس از مخلوط شدن با یکدیگر روی پوست پخش می شوند. بنابراین، این نمونه می تواند محلول رنگ آمیزی را تقلید کند که ممکن است در طول سنتز درجا CuNCs در ژل لمس شود. در مورد CuNC های سنتز شده، سولفات مس و اسید اسکوربیک قبل از پخش شدن به مدت 15 دقیقه با هم انکوبه شده اند تا وضعیت خارج کردن ژل را شبیه سازی کنند. شرایط موضعی ناحیه پوست تحت درمان و وضعیت کلی موش ها به طور مداوم در 30 روز مشاهده می شود. موش‌ها در نهایت تشریح می‌شوند تا تغییرات کبد را بررسی کنند. در تمام تحقیقات نانو

8 6 نانو رس. در موارد مشاهدات، هیچ ناهنجاری وجود ندارد (شکل 5 و شکل S14 در ESM). بنابراین، می توان نتیجه گرفت شکل 5 سمیت پوستی CuNC های سنتز شده در موش های صحرایی نر بالغ SD. وضعیت کلی و محلی موش‌ها پس از درمان با CuNCs یا H2O به عنوان شاهد برای 1 روز، 7 روز، و 30 روز ارائه شده‌است. وزن مربوط به موش ها و همچنین وزن کبد پس از تشریح در جدول زیر عکس ها نشان داده شده است. آزمایش‌ها روی دو گروه دیگر که به‌عنوان نمونه‌های تکراری کار می‌کردند نیز بدون نمایش انجام شد. بدیهی است که رنگ‌آمیزی CuNCs یک روش سبز است. در پایان می خواهیم یک بحث کوتاه داشته باشیم. سمیت رنگ‌های رنگ‌آمیزی معمولی باید عمدتاً به توانایی آنها در اتصال به DNA و در نتیجه تأثیرگذاری بر بیان ژن‌ها در داخل بدن نسبت داده شود. حل این مشکل غیرممکن به نظر می رسد، زیرا تعامل بین یک رنگ و یک رشته DNA نیز برای رنگ آمیزی در شرایط آزمایشگاهی ضروری است. اما باید توجه داشت که یکی دیگر از دلایل مهم سمی بودن رنگ های معمولی این است که ممکن است به پوست و غشای سلولی نفوذ کنند تا به هسته سلول برسند. این دلیل پیشرفتی را برای توسعه روش رنگ آمیزی سبز ارائه می دهد.

برخی از یون ها و مولکول های قطبی پلی اکریل آمید ( PAM )

(مانند Cu 2+ و اسید اسکوربیک) شناخته شده اند که از طریق انتقال فعال از غشای سلولی عبور می کنند. یعنی سلول ها این حق را برای خود محفوظ می دارند که تصمیم بگیرند که آیا می توانند وارد شوند یا نه. همچنین با در نظر گرفتن مانع پوستی برای این یون ها و مولکول های قطبی، آنها نیاز هدف ایمنی را برآورده می کنند. به عنوان یک اثبات مفهوم، در اینجا نشان می دهیم که این راه قابل دسترسی است. به طور خلاصه، ما یک روش رنگ آمیزی سبز DNA را در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بر اساس نانوخوشه های مس فلورسنت سنتز شده در محل ایجاد کرده ایم. پس از آزمایش های گسترده، در نهایت یک روش ساده به شرح زیر ایجاد می شود. ابتدا ژل پلی آکریل آمید در محلولی حاوی CuSO4 به مدت 15 دقیقه غوطه ور می شود. سپس، اسید اسکوربیک به محلول اضافه می شود و برای 15 دقیقه دیگر انکوبه می شود تا امکان سنتز درجا CuNC های فلورسنت با الگوی DNA فراهم شود. مراحل بالا دوباره تکرار می شود. و ژل برای تصویربرداری در زیر نور UV آماده است. عملکردهای جامع روش رنگ‌آمیزی مبتنی بر CuNC شامل حساسیت، پایداری، قابلیت استفاده و ایمنی مورد مطالعه قرار گرفته است. نتایج مطلوبی به دست می آید که به روش اجازه می دهد تا به عنوان جایگزینی برای روش های رنگ آمیزی ناایمن موجود عمل کند. به ویژه شایان ذکر است که معرف های به کار گرفته شده در این کار و کل فرآیند رنگ آمیزی ایمنی بالایی را نشان می دهند که البته باید با شواهد تجربی بیشتری در آینده تایید شود. اگرچه برخی محدودیت ها هنوز وجود دارد (به عنوان مثال حساسیت CuNC ها برای برخی از توالی های خاص به خوبی EtBr نیست)، این امکان را دارد که پس از بهینه سازی و بررسی بیشتر در آینده غلبه شود. مفهوم سنتز درجا نانومواد در سیستم بیولوژیکی ممکن است الهام بخش کاربرد در سایر بیوتکنولوژی ها نیز باشد. قدردانی این کار توسط بنیاد ملی علوم طبیعی چین (Grant No , )، صندوق ملی علوم برای

9 7 دانش پژوهان جوان ممتاز (شماره گرنت)، بنیاد علوم طبیعی شانگهای (14ZR)، و برنامه نوآوری کمیسیون آموزش شهرداری شانگهای (گرنت شماره 14YZ026). مواد تکمیلی الکترونیکی: مواد تکمیلی (جزئیات تجربی، شکل های تکمیلی) در نسخه آنلاین این مقاله در مراجع [1] Meyers, JA; سانچز، دی. الول، LP; Falkow, S. روش الکتروفورتیک ژل آگارز ساده برای شناسایی و خصوصیات پلاسمید دئوکسی ریبونوکلئیک اسید. J. bacteriol. 1976,127, [2] Lee, JD; هوانگ، CH; وانگ، شمال غربی؛ Lu, CS توالی یابی خودکار DNA برای ژل های الکتروفورز با استفاده از الگوریتم های پردازش تصویر. جی. بیومد. علمی مهندس 2011, 4, [3] Ogier, JC; پسر، او. گراس، ا. Tailliez, P. Delacroix-Buchet, A. شناسایی میکرو فلور باکتریایی در محصولات لبنی توسط الکتروفورز ژل شیب دمایی زمانی. Appl. محیط زیست میکروب. 2002، 68، [4] روتارو، آ. دوتا، اس. جنتزش، ای. گوتلف، ک. Mokhir, A. انتخابی dsdna-templated تشکیل نانوذرات مس در محلول. آنژو. شیمی. بین المللی ویرایش کنید. 2010, 49, [5] Yi, SH; Xu, LC; می، ک. یانگ، RZ; Huang، DX جداسازی و شناسایی نشانگرهای متیلاسیون DNA مرتبط با سن برای پیش‌بینی سن پزشکی قانونی. پزشک قانونی. علمی ژنرال داخلی 2014، 11، [6] Aaij, C.; Borst، P. الکتروفورز ژل DNA. بیوشیم. بیوفیز. Acta. 1972, 269, [7] Singer, VL; لاولور، TE; Yue, S. مقایسه جهش زایی رنگ آمیزی ژل اسید نوکلئیک سبز I SYBR (R) و جهش زایی اتیدیوم بروماید در سنجش جهش معکوس میکروزوم سالمونلا/پستانداران (آزمون ایمز). موتات. Res-Gen. سم. En. 1999, 439, [8] Ohta, T. توکیشیتا، اس. Yamagata، H. Ethidium bromide و SYBR Green I سمیت ژنتیکی تابش اشعه ماوراء بنفش و جهش‌زاهای شیمیایی را در E-coli افزایش می‌دهند. موتات. Res-Gen. سم. En. 2001, 492, [9] Yang, YY; چن، SW دستکاری سطحی انرژی الکترونیکی خوشه‌های طلا به اندازه زیر نانومتر: یک بررسی الکتروشیمیایی و طیف‌سنجی. نانو. Lett. 2003, 3, [10] Peyser, LA; وینسون، AE; بارتکو، AP; دیکسون، RM فلورسانس فتوفعال‌شده از نانوخوشه‌های نقره منفرد. علوم پایه. 2001، 291، [11] Hicks, JF; مایل، DT; موری، RW; شارژ دو لایه کوانتیزه نانوذرات فلزی با تک پراکندگی بالا. مربا. شیمی. Soc. 2002، 124، [12] Vosch, T. آنتوکو، ی. Hsiang، JC; ریچاردز، CI; گونزالس، جی. Dickson، RM نانوخوشه‌های Ag محصور شده با DNA به‌عنوان فلوروفورهای تک مولکولی با انتشار قوی. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 2007, 104, [13] Huang, CC; یانگ، ز. لی، KH; Chang، HT سنتز نانوذرات طلای بسیار فلورسنت برای سنجش جیوه (II). آنژو. شیمی. بین المللی ویرایش کنید. 2007، 46، [14] سیمن، NC DNA در دنیای مادی. طبیعت. 2003, 421, [15] Lin, CX; لیو، ی. رینکر، اس. یان، اچ. خودآرایی کاشی مبتنی بر DNA: ساختن نانومعماری های پیچیده. Chemphyschem. 2006، 7، [16] Lin, CX; لیو، ی. یان، اچ. طراحی نانومعماری DNA.

بیوشیمی.

، [17] شارما، ج. بله، HC; یو، اچ. ورنر، جی اچ. Martinez, JS پالت مکمل نانوخوشه‌های نقره فلورسنت. شیمی. اشتراک. 2010، 46، [18] روتارو، ا. دوتا، اس. جنتزچ، ای. گوتلف، ک. Mokhir, A. تشکیل انتخابی dsdna-templated نانوذرات مس در محلول. آنژو. شیمی. بین المللی اد. 2010, 49, [19] Petty, JT; ژنگ، جی. هاد، NV; دیکسون، تشکیل نانو خوشه نقره با الگوی DNA RM. مربا. شیمی. Soc. 2004، 126، [20] لیو، جی. شائو، ی. ما، ک. Cui، QH; وو، اف. Xu, SJ سنتز نانوخوشه‌های طلای فلورسنت با الگوی DNA. طلا. گاو نر 2012, 45, [21] Monson, CF; Woolley، AT-DNA-Templated Construction of Copper Nanowires. نانولت. 2003، 3، [22] Qing، ZH; او، XX; او، DG; وانگ، KM; Xu، FZ; چینگ، تی پی؛ یانگ، X. شکل گیری انتخابی نانوذرات مس فلورسنت با قالب پلی (تیمین). آنژو. شیمی. بین المللی ویرایش کنید. 2013، 52، [23] لیو، جی. شائو، ی. پنگ، جی. دای، دبلیو. لیو، LL; خو، اس جی. وو، اف. Wu, XH تشکیل نانوذرات مس فلورسنت بسیار وابسته به تیمین که توسط ss-dna قالب‌بندی شده است. فناوری نانو. 2013، 24، [24] Zhang، LL; ژائو، جی جی؛ دوان، ام. ژانگ، اچ. جیانگ، جی اچ. Yu, R. مهار نانوذرات مس با قالب dsdna توسط پیروفسفات به عنوان یک استراتژی فلورسنت بدون برچسب برای سنجش آلکالین فسفاتاز. مقعدی شیمی. 2013، 85، [25] Xu، FZ; شی، اچ. او، XX; وانگ، ک. او، DG; گوا، کیو. چینگ، ژ. یان، لس آنجلس; بله، XS; لی، دی. استراتژی نانوذرات مس با قالب dsdna Tang، JL با حساسیت و پایداری بهبود یافته بر اساس تکرار دایره غلتشی و کاربرد آن در تشخیص MicroRNA. مقعدی شیمی. 2014، 86، [26] Chen, JH; لیو، جی. نیش، ZY; Zeng، LW شکل‌گیری تصادفی نانوذرات مس با الگوی dsdna به عنوان کاوشگرهای فلورسانس جدید برای تشخیص یون‌های سرب بدون برچسب. شیمی. اشتراک. 2012, 48, [27] Pacioni, NL; فیلیپنکو، وی. پرسو، ن. Scaiano، JC اکسیداسیون نانوذرات مس در آب: بینش های مکانیکی نشان داده شده توسط جذب اکسیژن و روش های طیف سنجی دالتون T. 2013, 42, [28] Chen, TS; Zeng, SQ; ژو، دبلیو. لو، مدل تئوری کمی QMA مکانیزم فوتوبلیچینگ. فیس لت چینی 2003، 20، تحقیقات نانو

10 ماده تکمیلی الکترونیکی روش رنگ آمیزی سبز DNA در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید بر اساس نانوخوشه های مس فلورسنت سنتز شده درجا Xiaoli Zhu 1، Hai Shi 1، Yalan Shen 1، Bin Zhang 1، Jing Zhao 1، و Genxi Li 1،2 اطلاعات پشتیبانی برای DOI /s12274-****-****-* (به طور خودکار توسط ناشر درج می شود) جزئیات آزمایشی مواد شیمیایی و مواد. الیگونوکلئوتیدها (Oligos تضمین شده، با HPLC خالص شده) توسط Sangon Biotechnology Co. Ltd (شانگهای، چین) سنتز شدند. آکریل آمید و بی آکریل آمید نیز از سنگون خریداری شد. هگزا هیدرات کلرید منیزیم (MgCl2.6H2O)، پنتاهیدرات سولفات مس (CuSO4.5H2O)، کلرید پتاسیم (KCl)، کلرید سدیم (NaCl)، دی هیدرات مونوبازیک فسفات سدیم (NaH2PO4.2H2H2H2HPO4N)، دی هیدرات (NaH2PO4.2H2H2OH2O4N) اسید 3-(N-morpholino)-propane سولفونیک (MOPS)، تریس (هیدروکسی متیل) آمینو متان (Tris) و اسید اسکوربیک از Sigma-Aldrich خریداری شد. همه معرف ها از درجه معرف تحلیلی بودند. تمام محلول‌ها با آب دوبار تقطیر تهیه شدند که با یک سیستم تصفیه Milli-Q (Branstead، ایالات متحده آمریکا) تا مقاومت ویژه > 18 MΩ سانتی‌متر خالص شد.

تهیه نمونه DNA DNA دو رشته ای (dsdna)

و DNA با ساختار موچین با حل کردن اولیگونوکلئوتیدهای تک رشته ای و رشته های مکمل مربوطه در یک محلول بافر MOPS (10 میلی متر MOPS، 50 میلی متر MgCl2، ph 7.5) تهیه شد. سپس محلول تا دمای 95 درجه سانتیگراد گرم شد و به آرامی در حدود 2 ساعت تا دمای 25 درجه سانتیگراد خنک شد تا اطمینان حاصل شود که هیبریداسیون به طور کامل انجام می شود. نمونه واکنش زنجیره ای پلی اکریل آمید ( PAM ) هیبریداسیون (HCR) با انکوبه کردن سه الیگونوکلئوتید (یک پروموتر DNA P1، یک پروب H1 و یک پروب H2، توالی های نشان داده شده در ESM) با هم در یک محلول بافر (50 میلی متر Na2HPO4، 0.5 مولار NaCl) تهیه شد. ، ph 6.8) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت. کاوشگرهای H1 و H2 از قبل تا دمای 95 درجه سانتیگراد گرم شده بودند و به آرامی تا دمای 25 درجه سانتیگراد خنک شده بودند تا امکان تا شدن خود را در ساختار ساقه حلقه فراهم کنند. در طول انکوباسیون، پروموتر P1 ممکن است هیبریداسیون متناوب H1 و H2 را برای تشکیل یک زنجیره طولانی دو رشته ای آغاز کند. سنتز نانوخوشه‌های مس با الگوی DNA به منظور به دست آوردن CuNC با شدت فلورسانس بالا برای رنگ‌آمیزی، ابتدا شرایط سنتز را در غیاب ژل بهینه کردیم. اسید اسکوربیک و CuSO4 به طور متوالی به محلول DNA اضافه شدند و با هم به مدت 15 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند (dsdna30/40 آدرس مکاتبات به Genxi Li، genxili@nju.edu.cn. تحقیقات نانو

11 اتخاذ شد، توالی‌ها در ESM نشان داده شدند، غلظت نهایی اسید اسکوربیک، CuSO4 و DNA به ترتیب 1 میلی‌متر، 100 میکرومتر و 0.5 میکرومتر بود). چندین متغیر از جمله ph، بافر، قدرت یون و دما در نظر گرفته شد. CuNC های تولید شده با طیف سنجی UV-vis، طیف سنجی فلورسانس، و عکاسی تحت نور UV یا یک سیستم تصویربرداری Gel Doc XR (BioRad) مشخص شدند. الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید 12% غیر دناتوره کننده در بافر TBE در ولتاژ ثابت 120 ولت برای حدود 1.5 ساعت انجام شد. پس از الکتروفورز، ژل پلی آکریل آمید توسط CuNC های مس فلورسنت یا EtBr به عنوان شاهد رنگ آمیزی شد. در مورد رنگ آمیزی CuNCs، ژل پلی آکریل آمید ابتدا در محلول بافر MOPS 50 میلی لیتری (10 میلی متر MOPS، 50 میلی متر MgCl2، ph 7.5) حاوی 100 میکرومتر CuSO4 به مدت 15 دقیقه غوطه ور شد. سپس اسید اسکوربیک با غلظت نهایی 1 میلی متر به محلول اضافه شد و به مدت 15 دقیقه دیگر انکوبه شد تا امکان سنتز CuNC ها فراهم شود. ژل دو بار با تکرار روش فوق برای افزایش شدت فلورسانس رنگ آمیزی شد. برای رنگ آمیزی EtBr، پلی اکریل آمید ( PAM )

ژل در محلول EtBr (300 میلی لیتر، 0.5 میکروگرم بر میلی لیتر)

به مدت 15 دقیقه پس از انجام الکتروفورز در دمای 25 درجه سانتیگراد غوطه ور شد. ژل در هر دو مورد در نهایت با استفاده از سیستم تصویربرداری Gel Doc XR خارج شد و تصویربرداری شد. یک فیلتر برای تحریک EtBr (~302 نانومتر) در طول آزمایش‌ها به کار گرفته شد (یک سیستم تصویربرداری با تحریک بهینه در 343 نانومتر ممکن است برای رنگ‌آمیزی مبتنی بر CuNCs بهتر باشد). سایر پارامترهای سیستم تصویربرداری به عنوان مقادیر پیش فرض حفظ شدند. تست سمیت پوستی تمام روش های حیوانی مطابق با دستورالعمل های سازمانی و ملی و با تایید کمیته اخلاق مراقبت از حیوانات دانشگاه شانگهای انجام شد. موش های صحرایی نر بالغ SD با وزن 56.9 ± گرم در دریافت از دانشگاه فودان خریداری و در گروه های 2 تایی در قفس های پلاستیکی نگهداری شدند. موش‌ها به‌طور تصادفی در دو گروه کنترل و آزمایش قرار گرفتند. پوست پشت موش‌ها با کرم موبر درمان شد و با یک تیغ برقی تراشیده شد تا ناحیه‌ای بدون کرک حدود 20 سانتی‌متر میکرولیتر سولفات مس (100 میکرومتر) یا اسید اسکوربیک (1 میلی‌متر) یا CuNC‌های سنتز/سنتز شده یا دو تقطیر شده به دست آید. آب به عنوان شاهد به طور یکنواخت بر روی ناحیه در معرض پوست پخش شد. پس از 24 ساعت، ناحیه پوست تحت درمان شسته شد تا معرف ها حذف شوند. و نمونه های تازه دوباره اعمال شد. روند درمان در طول یک ماه تکرار شد. شرایط موضعی ناحیه پوست تحت درمان و وضعیت کلی موش‌ها به‌طور مداوم توسط آزمایش‌کنندگان مشاهده و ثبت شد. در نهایت موش ها به قتل رسیدند. اندام های داخلی مشاهده شد. و کبد برای بررسی وجود هپاتومگالی وزن شد. جدول S1 توالی DNA نام poly(a) 40 poly(t) 40 poly(taa) 40 poly(att) 40 poly(c) 40 poly(cgg) 40 poly(gcc) 40 dsdna 21 Sequence 5′-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A-3′ 5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T-3′ 5′-TAA TAA TAA TAA TAA TAA TAA -3′ 5′-ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT A -3′ 5′-CCCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC C-3′ 5′-CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG C-3′ 5′-GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC GCC G-3′ 5′-TAC TCA TAC GCT CAT GAC TTC-3′

12 3′-ATG AGT ATG CGA GTA CTG AAG-5′ dsdna 20/30 dsdna 30/40 HIV 42 Hly 44 HBV 30

با ساختار موچینی ساختار سنجاق DNA

با ساختار ured DNA 3′-GTA TGC AAG TAGG TG5C ‘ 5′- CTC ATA CGC TCA TAC GTT CAT CAC GAC TAC-3′ 5′- CTC ATA CGC TCA TAC GTT CAT CAC GAC TAC-3′ 3′-TCT TAC TGA TGA GTA TGC GAG TAT GCA AGT AGT GCT GAT G -5′ 5′-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA AAA GGG TCT GAG GGA-3′ 3′- TGA CCT CTA AAA GGT GTG ACT GAT TTT CCC AGA CTC CCT-5′ 5′-TCT CCG CCT GCA AGT CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA CAC GC-3′ 3′-AGA GGC GGA CGT TCA GGA TTC TGC GGT TAG CTT TTC TTT GTG CG-5′ 5′-ATA CCA CAT CAT CCA TAT AAC TGA AAG CCA-3′ 3′-TAT GGT GTA GTA GGT ATA TTG ACT TTC GGT-5′ 5′-TAA TTA TTT ATT ATA TAT ACC CCC CCA TAT ATA TTA TTT ATT AAT-3′ 5′-TTA TAT GAA ACC AGA AAA TTA ATA TAA TTA پلی اکریل آمید ( PAM ) ATA ATT A-3′ 5′-ATT AAT AAA TA TAT ATA TAA AAC CAA GGA ATT ATA T-3′ 5′-ACC TCA TTG TAT AGC TGA GGT AGT AGG TTG TAC AAC TAT ACA ACC TAC TAC CT-3 P1: 5′-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA-3′ HCR تقویت هیبریداسیون DNA-RNA H1: 5′-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3′ H2: 5′-TTA ACC CAC GCC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG-3′ RNA: 5′-GGG CGA CCC UGA UGA GGC CUU CGG GCC GAA ACG GUG AAA GCC GUC GGU CGC CC-3′ DNA: 3′-CCC GCT GGG ACT ACT CCG GAA GCC CGG CGG CTT TGC CAC TTT CGG GCC GUC GGU CGC CC-3’ تحقیقات نانو

13 شکل S1 اثر ph بر تشکیل CuNC های فلورسنت با الگوی DNA در محلول بافر (10 میلی متر MOPS حاوی 150 میلی متر NaCl، 0.5 میکرومتر dsdna30/40، 100 میکرومتر CuSO4، و 1 میلی متر اسید اسکوربیک). عکس‌ها 15 دقیقه پس از مخلوط کردن همه معرف‌ها با یکدیگر گرفته شد.

شکل S2 تشکیل CuNC های فلورسنت با الگوی DNA در محلول های بافر مختلف پلی اکریل آمید ( PAM ) با ph 7.5. غلظت MOPS، Tris و PBS همگی 10 میلی متر است. یون های مختلفی نیز در آن دخالت دارند که نوع و غلظت آنها در بالای شکل مشخص شده است. مرجع. [1] شرایط بافر را از مرجع [1] نشان می دهد: بافر MOPS 10 میلی متری حاوی 150 میلی متر NaCl. شرایط دیگر مانند شکل S نانوتحقیق است

15 شکل S3 اثر قدرت یونی بر تشکیل CuNC های فلورسنت با قالب DNA در محلول بافر MOPS 10 میلی متری (ph 7.5). غلظت NaCl از 1 تا 8 به ترتیب 25، 50، 75، 100، 200، 300، 400 و 500 میلی متر است. MgCl2: 0، 5، 15، 25، 50، 100، 150، 200 میلی متر؛ KCl: 0، 25، 50، 100، 200، 300، 400، 500 میلی متر. C نشان دهنده یک گروه کنترل است که در آن DNA وجود ندارد. غلظت یون های گروه کنترل به ترتیب 100 میلی متر NaCl، 50 میلی متر MgCl2 و 100 میلی متر KCl است. شرایط دیگر مانند شکل S1 است.

16 شکل S4 اثر دما بر تشکیل CuNC های فلورسنت با الگوی DNA در محلول بافر MOPS 10 میلی متری حاوی 50 میلی متر MgCl2 (ph 7.5). شرایط دیگر مانند شکل S نانوتحقیق است

17 شکل S5 فلورسانس CuNCهای فلورسنت با الگوی DNA تحت نور UV. CuNC ها در یک بافر MOPS (10 میلی متر MOPS، ph 7.5، 50 میلی متر MgCl2، 0.5 میکرومتر dsdna30/40، 100 میکرومتر CuSO4، و 1 میلی مولار اسید اسکوربیک) در دمای 25 درجه سانتی گراد برای زمان واکنش های مختلف سنتز شدند.

18 شکل S6 طیف فلورسانس CuNC های فلورسنت با الگوی DNA. شرایط دیگر مانند شکل S نانوتحقیق است

19 شکل S7 طیف UV-vis از CuNC ها، که در یک بافر MOPS (10 میلی متر MOPS، ph 7.5، 50 میلی متر MgCl2، 100 میکرومتر CuSO4، و 1 میلی مولار اسید اسکوربیک) در دمای 25 درجه سانتی گراد در غیاب الگوی DNA برای موارد مختلف سنتز شدند. زمان پاسخ.

20 شکل S8 طیف UV-vis از CuNC ها، که در یک بافر MOPS (10 میلی متر MOPS، ph 7.5، 50 میلی متر MgCl2، 100 میکرومتر CuSO4، و 1 میلی مولار اسید اسکوربیک) در دمای 25 درجه سانتی گراد در حضور ssdna30 میکرومتر سنتز شدند. ) به عنوان الگو برای زمان واکنش های مختلف. جذب اسید اسکوربیک و DNA در 260 نانومتر همپوشانی دارد. جذب واقعی DNA زمانی ظاهر می شود که اسید اسکوربیک تمام شود. تحقیقات نانو

21 شکل S9 طیف UV-vis از CuNC ها، که در یک بافر MOPS (10 میلی متر MOPS، ph 7.5، 50 میلی متر MgCl2، 100 میکرومتر CuSO4، و 1 میلی مولار اسید اسکوربیک) در دمای 25 درجه سانتی گراد در حضور dsdna30/40 سنتز شدند. 0.5 میکرومتر) به عنوان الگو برای زمان واکنش های مختلف. جذب اسید اسکوربیک و DNA در 260 نانومتر همپوشانی دارد. جذب واقعی DNA زمانی ظاهر می شود که اسید اسکوربیک تمام شود.

22 شکل S10 طیف UV-vis از CuNC ها، که در یک بافر MOPS (10 میلی متر MOPS، ph 7.5، 50 میلی متر MgCl2، 100 میکرومتر CuSO4، و 1 میلی مولار اسید اسکوربیک) در دمای 25 درجه سانتی گراد در حضور dsdna20/30 سنتز شدند. 0.5 میکرومتر) به عنوان الگو برای زمان واکنش های مختلف. جذب اسید اسکوربیک و DNA در 260 نانومتر همپوشانی دارد. جذب واقعی DNA زمانی ظاهر می شود که اسید اسکوربیک تمام شود. تحقیقات نانو

23 شکل S11 نردبان نشانگر DNA II (0.5 میکروگرم) در ژل پلی آکریل آمید با استفاده از رنگ‌آمیزی مبتنی بر CuNCs در شرایط مختلف. سمت چپ ترین باند تحت شرایط بهینه انجام می شود (10 میلی متر MOPS، ph 7.5، 50 میلی متر MgCl2، در 25 درجه سانتی گراد). بقیه با شرایط بهینه شده با تک متغیره که روی نردبان مشخص شده است متفاوت هستند.

24 شکل S12 نردبان نشانگر DNA II با مقادیر مولی متفاوت در ژل پلی آکریل آمید با استفاده از رنگ آمیزی EtBr. تحقیقات نانو

25 شکل S13 فلورسانس نمونه های مختلف رنگ آمیزی شده توسط CuNC (سمت چپ) و EtBr (راست) در ژل پلی آکریل آمید. از خط 1 تا 9: poly(a)40، poly(t)40، poly(taa)40، poly(att)40، poly(c)40، poly(cgg)40، dsdna(at)40، dsdna( taa-att)40، dsdna(cgg-gcc)40. عدد زیرمجموعه تعداد پایه ها/جفت های پایه را نشان می دهد. غلظت تمام اسیدهای نوکلئیک در 0.5 میکرومتر ثابت است. نوارهای موجود در جعبه قرمز آنهایی هستند که می توانند توسط CuNC و EtBr رنگ آمیزی شوند، در حالی که جعبه های سبز و آبی نوارهایی را نشان می دهند که فقط می توانند توسط CuNC یا EtBr رنگ آمیزی شوند.

26 شکل S14 سمیت پوستی CuSO4، اسید آسکوربیک، و سنتز CuNC در موش های صحرایی نر بالغ SD. حالات کلی و موضعی موش‌ها پس از درمان با 100 میکرومتر CuSO4، یا 1 میلی‌متر اسید آسکوربیک، یا سنتز CuNCs (CuSO4 و اسید اسکوربیک به طور همزمان بر روی پوست پخش شدند) برای 1 روز، 7 روز و 30 روز ارائه شده‌اند. وزن مربوط به موش ها و همچنین وزن کبد پس از تشریح در جدول زیر عکس ها نشان داده شده است. آزمایش‌ها روی دو گروه دیگر که به‌عنوان نمونه‌های تکراری کار می‌کردند نیز بدون نمایش انجام شد. مرجع [1] Rotaru, A.; دوتا، اس. جنتزچ، ای. گوتلف، ک. مخیر، ع آنژیو. شیمی. بین المللی ویرایش، 2010، 49، تحقیقات نانو